[发明专利]基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法

权利要求书

1.一种基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法，其特征是：包含以下步骤：

（1）筛选引物：根据GeneBank的已发表序列，利用DNAMAN软件进行多重比对，获得KPC和NDM基因保守区，利用Primer Premier6.0和Oligo 6软件设计了多对特异性引物，经优化筛选出最佳引物组合为 KPC-F/R和NDM-F/R；

（2）菌株的培养和DNA提取：选用携带KCP和NDM基因的肺炎克雷伯菌，将细菌接种于血平板上，分区划线培养，挑取单个菌落，将其悬浮于100μＬ灭菌去离子水，然后按照天隆核酸提取试剂盒说明书用全自动核酸提取仪进行提取DNA,至-20℃ 保存备用；

（3）制备不对称PCR体系：分别以提取的KCP和NDM 基因组的DNA作为模板，对KCP和NDM进行不对称PCR条件的优化，以获取相应的生物素标记的目标单链DNA，在PCR体系中加入不等量的一对引物进行目标基因的扩增，在扩增后期中生成大量的生物素化的单链DNA（Biotin-modifiedsingle-strained DNA，Biotin-ssDNA）备用；

（4）制备核酸免疫层析试纸条：在NC膜上喷涂一定质量浓度的生物编码探针即：链霉亲和素-生物素-DNA偶联物（Streptavidin-Biotin-DNA）作为检测线和质控线；将链霉亲和素修饰的胶体金颗粒(Streptavidin-AuNPs)偶联物喷到结合垫上、烘干备用，将滤纸、结合垫、NC膜、吸水纸按顺序贴于PVC底板上，切成3 mm宽、70mm长的免疫层析试纸条，使组件之间的流体平稳流动，制备好的试纸条置于密封袋中，干燥阴凉条件下保存；

（5）进行胶体金核酸免疫免疫层析检测，并读取结果。

2.根据权利要求1所述的基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法，其特征是：所述常规PCR扩增耐碳青霉烯类的肺炎克雷伯菌KCP和NDM基因采用扩增上、下引物量1：1，以常规PCR成功扩增出基因的KCP为131bp和NDM为133 bp条带；最终优化得出当两种基因上游引物与下游引物添加浓度比为1∶20时，制备的目标单链DNA产量多，因此，得出KCP和NDM最佳上、下游引物浓度比为1：20。

3.根据权利要求1所述的基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法，其特征是：所述在制备不对称PCR体系过程中，循环扩增末期会产生大量的单链DNA产物，对不对称PCR反应循环数进行优化，综合考虑KCP和NDM选取循环数为35最优。

4.根据权利要求1所述的基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法，其特征是：在进行KPC、NDM不对称PCR不同退火温度的胶体金免疫层析检测时，KPC和NDM在退火温度为55 ℃的条带较量亮，产生的二聚体较少，其检测线的平均灰度值最高分别为585和435.3，所以最优选取55 ℃作为不对称PCR反应的退火温度。

5.根据权利要求1所述的基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法，其特征是：所述不对称PCR体系中引物的添加量影响整个扩增过程中目标单链DNA产物的生成量，适当提升引物加入量能够增加扩增末期时所产生目标单链DNA，因此，对不对称PCR体系中引物加入量进行优化，随着体系中引物浓度的增加，目标单链DNA产物的生成量也随之增加，当KCP和NDM上游引物终浓度为0.03μmol/L时，双链DNA被消耗较多，产生目的单链DNA较多，不浪费引物量，继续提高引物的浓度，对免疫层析效果没有显著影响，故选择KCP和NDM上游引物终浓度为0.03μmol/L。