[发明专利]基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法

说明书

本发明公开了一种基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法，属于生物学检测技术领域，本发明设计用生物素标记的耐药基因KPC和NDM的下游引物（Biotin‑R）对目标基因进行不对称PCR扩增，获得生物素化的目标单链DNA（Biotin‑ssDNA）。通过胶体金侧流层析试纸条试验与其互补的生物编码DNA探针相互作用形成可视的显色条带，从而判断有无该耐药基因。提出的诊断测试的主要优点是简单、安全和成本效益，快速分析在15 min内完成，高检测性、灵敏度、特异性和再现性、普遍性和便携性，而检测是通过肉眼完成的，不需要昂贵的仪器或训练有素的人员。结果判定便利、直观，可实现现场快速检测的目的，适用于基层医疗使用。

技术领域

本发明涉及生物学检测技术领域，具体为一种基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法。

背景技术

随着碳青霉烯类抗菌药物的广泛应用，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌检出率呈逐年上升的态势，特别是耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌上升幅度明显。我国 CRE 以肺炎克雷伯菌为主，而 CRE 导致的感染病死率达到 47% ，且 CRE的定植率、检出率、耐药率、死亡率一直呈上升趋势给感染治疗带来极大的挑战。据全国耐药检测网数据，CR-KP检出率从2013年的4.9%上升至2020年的10.9%，碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（CR-KP）的耐药率也呈现明显上升趋势。CRKP感染在国内呈现出持续高发的现象，严重威胁人类健康。

经检索，中国专利号：CN202120018817.7，公开了一种肺炎克雷伯菌粘丝实验检测装置，该装置具有便于将放置板拆卸下来进行消毒，且便于将其固定在装置上，便于对一些盛装检测药剂的试管进行限位固定，便于对一些检测用的工具进行存放的一种肺炎克雷伯菌粘丝实验检测装置，使其提高检测的准确性，提高检测的效率，便与检测人员进行使用。当该发明仍存在以下问题：

该发明中检测方法通量有限，检测时受限于琼脂糖凝胶电泳的低分辨率和荧光素的种类，而且检测时会受到用到的仪器昂贵和检测条件要求高的限制，不利于现场即时检测和条件落后地区的开展。

发明内容

本发明的目的在于克服上述背景技术困难，提供一种基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法。

为达到上述目的，采用的技术方案为：一种基于非对称PCR和生物编码探针技术的多重耐碳青霉烯酶基因胶体金免疫层析快检新方法，包含以下步骤：

（1）筛选引物：根据GeneBank的已发表序列，利用DNAMAN软件进行多重比对，获得KPC和NDM基因保守区，利用Primer Premier6.0和Oligo 6软件设计了多对特异性引物，经优化筛选出最佳引物组合为 KPC-F/R和NDM-F/R；

（2）菌株的培养和DNA提取：选用携带KCP和NDM基因的肺炎克雷伯菌，将细菌接种于血平板上，分区划线培养，挑取单个菌落，将其悬浮于100μＬ灭菌去离子水，然后按照天隆核酸提取试剂盒说明书用全自动核酸提取仪进行提取DNA,至-20℃ 保存备用；

（3）制备不对称PCR体系：分别以KCP和NDM 基因组的DNA作为模板，对KCP和NDM进行不对称PCR条件的优化，以获取相应的生物素标记的目标单链DNA，在PCR体系中加入不等量的一对引物进行目标基因的扩增，在扩增后期中生成大量生物素化的单链DNA（ Biotin-modified single-strained DNA，ssDNA）备用；

（4）制备核酸免疫层析试纸条：在NC膜上喷涂一定质量浓度的生物编码探针即：链霉亲和素-生物素-DNA偶联物（SA-Biotin-DNA）作为检测线和质控线；将链霉亲和素修饰的胶体金颗粒(SA-AuNPs)偶联物喷到结合垫上、烘干备用，将滤纸、结合垫、NC膜、吸水纸按顺序贴于PVC底板上，切成3 mm宽、70mm长的免疫层析试纸条，使组件之间的流体平稳流动，制备好的试纸条置于密封袋中，干燥阴凉条件下保存；

（5）进行胶体金核酸免疫侧流层析检测，并读取结果。