[发明专利]一种小体积样本脂溶性维生素D的定量检测方法

权利要求书

1.一种小体积样本脂溶性维生素D的定量检测方法，其特征在于：其包括以下步骤：

（1）样本的制备

①使用深孔板，加入内标溶液和血清或者血浆样本，振荡混匀；

②加入萃取试剂后离心，吸取上清液至另一离心管中，吹干；

③加入衍生化试剂，振荡离心后避光衍生，进行吹干；

加入复溶液振荡混匀，得到待检溶液；

（2）检测条件

① 色谱条件

色谱柱：反相色谱柱：柱温：＜60℃，流速：0.3-0.5ml/min；

流动相体系：水-甲醇体系，采用梯度洗脱；

②质谱条件

离子源：电喷雾离子源，正离子模式，扫描模式：多反应监测MRM模式；

（3）结果记录

将步骤（1）中的制备好的待检溶液注入LC-MS/MS中，记录色谱图，获得多种脂溶性维生素D2和维生素D3的保留时间及质谱数据。

2.根据权利要求1所述的一种小体积样本脂溶性维生素D的定量检测方法，其特征在于：

步骤（1）中的所述的内标溶液为25-羟基维生素D的同位素甲醇溶液。

3.根据权利要求1所述的一种小体积样本脂溶性维生素D的定量检测方法，其特征在于：步骤（1）所述的萃取试剂为甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、环己烷中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的一种小体积样本脂溶性维生素D的定量检测方法，其特征在于： 步骤（1）所述的离心条件为3500-5000rpm，离心4-6min。

5.根据权利要求1所述的一种小体积样本脂溶性维生素D的定量检测方法，其特征在于：步骤（1）所述的衍生化试剂为4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮。

6.据权利要求1所述的一种小体积样本脂溶性维生素D的定量检测方法，其特征在于：步骤（1）所述的复溶液为水、甲酸、甲醇、乙腈、异丙醇中的至少一种。

7.据权利要求1所述的一种小体积样本脂溶性维生素D的定量检测方法，其特征在于：步骤（2）所述的反向色谱柱为十八烷基硅烷键合的C18色谱柱。

8.据权利要求1所述的一种小体积样本脂溶性维生素D的定量检测方法，其特征在于：步骤（2）所述的流动相体系为A相0.1%的甲酸水溶液，B相为0.1%甲酸甲醇溶液。

9.据权利要求8所述的一种小体积样本脂溶性维生素D的定量检测方法，其特征在于：所述梯度洗脱条件为：0-3min：70-90vol%B相，3-4.1min：80-90vol%B相，4.1-5min：70-90vol%B相。

10.据权利要求1所述的一种小体积样本脂溶性维生素D的定量检测方法，其特征在于：步骤（2）所述多级反应监测MRM模式的条件为：25-羟基维生素D2,m/z 570.5＞298.2,25-羟基维生素D2-d6，m/z 576.5＞298.2；25-羟基维生素D3 m/z 558.5＞298.2,25-羟基维生素-D3-d6 m/z 564.5＞298.2。