[发明专利]一种小体积样本脂溶性维生素D的定量检测方法

说明书

本发明公开了一种小体积样本脂溶性维生素D的定量检测方法，属于分析检测技术领域，其包括以下步骤：取血清或者血浆样本，依次加入萃取试剂和衍生化试剂进行处理，然后加入复溶液振荡混匀，得到待检溶液，然后采用LC‑MS/MS进行定量检测，本发明检测方法简单，样本用量小，进行实验，对0‑12月的儿童来说只需采取30μl指尖血，每个样本只需5min，解决了临床采样难度大，无法进行检测的问题。

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种小体积样本脂溶性维生素D的定量检测方法。

背景技术

维生素D是一类脂溶性维生素，与健康关系比较密切的是维生素D2和维生素D3。维生素D具有广泛且重要的生理功能，其主要作用是调节人体内的钙磷平衡，与机体免疫、神经、生殖、内分泌、骨骼和毛发生长等功能密切相关。维生素D的缺乏与多种疾病相关：如骨质疏松、儿童骨发育不良(佝偻病)、妇女高发先兆子痫、早产、细菌性阴道炎和妊娠期糖尿病、心脑血管疾病、糖尿病、自身免疫性疾病、肾脏及肿瘤。研究显示，全世界约有10亿人存在维生素D缺乏或不足，而我国维生素D缺乏情况也很严重，缺乏率达40％。虽然维生素D缺乏可以通过补充维生素D来治疗，但盲目的补充维生素D的也可能造成严重后果，如引起过量、中毒、甚至死亡。近年来我国也陆续报道了较多维生素D过量或中毒病例。

因此，通过维生素D的检测来了解机体维生素D的含量，能为疾病的精准防治提供依据，从而减少因维生素D缺乏或过量给健康带来的危害。25(OH)D是机体维生素D的主要储存形式，包含25(OH)D3和25(OH)D2；占体内维生素D总量95％以上，因此被公认为是客观评价维生素D营养状况的最佳指标。

目前报道的脂溶性维生素D检验方法很多，比如中国专利申请CN108645942A、CN109001329A、CN109212091A等，目前的这些液相质谱方法的衍生化法或者非衍生方法大多要求血清样本200μl，而年龄较小0-12月孩子采静脉血难度较大且容易溶血，对实验造成较大影响。

目前亟需样本量少、检测通量大的脂溶性维生素D的检测方法。

发明内容

本发明的目的就在于提供一种小体积样本脂溶性维生素D的定量检测方法，以解决上述问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种小体积样本脂溶性维生素D的定量检测方法，其包括以下步骤：

(1)样本的制备

①使用深孔板，加入内标溶液和血清或者血浆样本，振荡混匀；

②加入萃取试剂后离心，吸取上清液至另一离心管中，吹干；

③加入衍生化试剂，振荡离心后避光衍生，进行吹干；

加入复溶液振荡混匀，得到待检溶液；

(2)检测条件

①色谱条件

色谱柱：反相色谱柱：柱温：＜60℃，流速：0.3-0.5ml/min；

流动相体系：水-甲醇体系，采用梯度洗脱；

②质谱条件

离子源：电喷雾离子源，正离子模式，扫描模式：多反应监测MRM模式；

(3)结果记录

将步骤(1)中的制备好的待检溶液注入LC-MS/MS中，记录色谱图，获得多种脂溶性维生素D2和维生素D3的保留时间及质谱数据。

作为优选的技术方案：步骤(1)中的所述的内标溶液为25-羟基维生素D的同位素甲醇溶液。

作为优选的技术方案：步骤(1)所述的萃取试剂为甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、环己烷中的至少一种。