[发明专利]一种对7种疟原虫检测并分型的引物探针组合、试剂盒及检测方法

说明书

本发明提供一种对7种疟原虫检测并分型的引物探针组合、试剂盒及检测方法，所述7种疟原虫为无性期恶性疟原虫pf‑a、有性期恶性疟原虫pf‑s、间日疟原虫pv、卵形疟原虫poc亚型、卵形疟原虫pow亚型、三日疟原虫pm、诺氏疟原虫pk，所述引物探针组合包括：fp1、rp1、tp1；rp2；tp2、tp3、tp4、tp5、tp6、tp7、tp8；fp2、fp3、fp4、fp5、fp6、fp7；fp8、fp9、rp3、tp9。本发明采用荧光PCR技术结合熔解曲线分析，在PCR高灵敏度、高特异性检测的基础上实现了对疟原虫合种型别的高通量检测，整个过程设计巧妙，操作简单，为临床提供一种更加便捷的检测方法。

技术领域

本发明借助于材料的化学或物理性质分析材料，属于体外诊断试剂领域，具体的，涉及一种对7种疟原虫检测并分型的引物探针组合、试剂盒，以及利用荧光PCR结合熔解曲线分析技术检测人体疟原虫的方法。

背景技术

疟疾是由疟原虫所引起的能威胁生命的疾病。疟疾严重危害人类健康，与艾滋病、结核病一起被世界卫生组织列为全球性亟需控制的公共卫生问题。2019年有2.41亿例疟疾病例，62.7万人死亡，全世界一半以上人口面临疟疾风险。其病原微生物疟原虫种类复杂，一旦延误治疗，极易发展成死亡率较高的重症疟疾，准确的早期诊断能减少疾病并预防死亡，还有助于减少疟疾传播。

人体疟原虫有5种，即恶性疟原虫(plasmodium falciparum，pf)、间日疟原虫(Plasmodium vivax，pv)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale，po)、三日疟原虫(Plasmodiummalariae，pm)、诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi，pk)，其中pf、pv的危害最大。据统计，2017年pf占世界卫生组织非洲区域疟疾病例估计数的99.7％，以及世界卫生组织东南亚区域(62.8％)、东地中海区域(69％)和西太平洋(71.9％)疟疾病例的大多数，其中，pf根据其生活史分为有性期pf-s和无性期pf-a；pv是世界卫生组织美洲区域的主要寄生虫，占疟疾病例的74.1％；po大多分布在非洲各地，近些年有部分学者将po分为poc(Plasmodiumovale curtisi)、pow(Plasmodium ovale wallikeri)两个亚型别，据研究表明，pow比poc在临床上会引起更为严重的血小板减少症(p＝0.031)，除此之外，pow的窗口期也比较短；pm和pk是临床最难鉴别的两种型别，其中pm是早期发现的可感染人的疟原虫种类，pk是近些年发现的第五种人体疟原虫。

依据【WS 259-2015疟疾的诊断】，对于疟原虫的检测方法主要有显微镜查血涂片、抗原检查、核酸检查。显微镜镜检作为WHO推荐的标准检测方法，检测结果可靠，但是操作人员需要有严格的经验要求，且poc和pow、pm和pk在镜检时很难区分，因此很难满足检测需要；抗原检查可以实现快速检测，也是当下医学检验对病原微生物常用的检测方法之一，但检测灵敏度较差，对于一些感染窗口期的疟疾患者很容易漏检。

上述疟原虫在基因组上具有高度的相似性，其中pf-a和pf-s、poc和pow突变位点极少，采用实时荧光PCR法进行区分时，会出现误判的风险，而熔解曲线针对1个碱基的差异，会体现出Tm值宏观上的差异，因此对pf-a和pf-s、poc和pow能做到精准的判读。熔解曲线的实现有着很多种方法，而大多数采用不对称扩增实现熔解曲线分析，而不对称熔解曲线分析的前提是限制了其中一条引物，从而检测灵敏度存在减低的可能，其次也有部分学者采用连接酶技术实现熔解曲线，但是该方法需要再扩增后开盖，从而增加了环境污染的可能。

综上所述，开发一种用于鉴别疟原虫型别的通量高、检测准度优异的试剂对疟疾的监控和临床诊断具有很重要的意义。

发明内容

为解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明基于荧光PCR技术结合熔解曲线分析，在PCR快速、稳定、特异性强和灵敏度高等优势的基础上，实现了单色荧光通道内多种基因的检测，从而大大提高了通量，实现在1管反应液中做出对疟原虫的定性检测，并且同时对阳性疟原虫样品做出具体的分型分析。