[发明专利]一组检测猪轮状病毒的引物和探针及其应用

说明书

本发明公开了一组检测猪轮状病毒的引物和探针及其应用，属于病毒检测领域。引物和探针包括：PoRV F2如SEQ ID NO：3所示，PoRV R如SEQ ID NO：2所示，PoRV Pro如SEQ ID NO：9所示；其中，所述PoRV Pro的5'端标记荧光基团，所述PoRV Pro的第31位碱基替换为四氢呋喃，3'末端标记聚合酶延伸阻断基团。本发明能高灵敏度、特异性检测猪轮状病毒，并且具备成本低、便于携带、不受实验室仪器限制可以现场检测，适合应用于基层人员和偏远地区在猪轮状病毒快速检测中。

技术领域

本发明涉及病毒检测领域，特别是涉及一组检测猪轮状病毒的引物和探针及其应用。

背景技术

猪轮状病毒(porcine rotavirous,PoRV)属于呼肠孤病毒科，轮状病毒属、基因组双链RNA病毒，病毒包含11段双链RNA，基因全长为18.2kbp编码6种结构蛋白(VP1-VP4,VP6和VP7)和5种非结构蛋白(NSP1-NSP5)。病毒粒子有3层衣壳，呈20面体对称。病毒粒子的11种蛋白，VVP4、VP6和VP7决定着病毒的感染性和免疫性；VP1、VP2、VP3与NSP2、NSP4、NSP5是RNA结合蛋白，其与基因复制、合成表达相关；VP1、VP2、VP3是病毒核心蛋白。

现有技术中分离鉴定病毒的方法有多种，如：

PoRV病毒分离鉴定：采集24h之内的小肠或者粪便，利用细胞培养系培养传代分离病毒、接种增殖，一般选用PK细胞或ST细胞系，使用免疫荧光或者PCR方法进行鉴定。该方法缺点是费时费力，试验周期较长、操作复杂，对实验室仪器设备和实验人员实验操作技能有较高的要求，不能满足快速检测的要求。病毒分离的方法存在许多弊端，如细胞培养过程中易出现污染，污染的细胞与病毒感染后的形态难以区分，并且需通过大量时间来观察细胞病变。此外，胎儿死亡时间如果较长，检测的PoRV感染力可能出现一定的偏差。此项技术还需与免疫荧光技术相结合，在面对临床大规模检测时，实施此方法检测病毒难度较大。

酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay)：多使用夹心ELISA方法，利用抗原抗体之间的特异性结合，加入检测抗体的酶标抗体，通过显色液反应读取结果。但ELISA结果受试验材料限制较大，抗体的质量会直接影响试验结果的准确性，传统抗体的制备、纯化和标记程序复杂且成本较高，提高了样品检测的成本。在检测结果中容易受到主观因素的影响，并且该方法不能做到对检测样品的扩增，在敏感性方面也有一定的欠缺。

免疫荧光：免疫荧光抗体技术的原理是：将抗体分子与一些示踪物质如荧光素等结合，利用抗原抗体反应形成抗原—抗体复合物，在荧光显微镜下观察特异性荧光进行检测。但是，此方法需要专业的大型试验仪器设备，试验流程耗时较长，不利于大批量样品的快速检测。

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)：通过合成上下游的亲本两条寡核苷酸或引物，通过变性、退火、延伸进行扩增。扩增反应时间较长，需要实验室专业的技术人员和专业PCR仪器，不能满足现场检测的需要。

核酸杂交探针技术：通过有一定同源性的核酸单链，在一定条件下碱基互补形成双链。该技术操作成本高、而且操作步骤繁琐。

荧光探针技法：目前最常用的有TaqMan探针、分子信标(Molecular beacons)、LUXPrimres等方法。需要实验室大型仪器配合、检测成本高、操作步骤繁琐。

基于现有技术中分离鉴定病毒的方法存在上述提及的多种缺陷，因此需要一种具备便于携带、不受实验室仪器限制、不需要专业人员操作、灵敏度高、特异性强等特点，适于基层人员和偏远地区使用的快速检测方法。

发明内容