[发明专利]一种用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR-Cas9系统

说明书

本发明公开了一种用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR‑Cas9系统，包含：将发生在杜氏肌营养不良症(DMD)基因27号外显子的点突变或无义突变通过碱基的删除或添加将(3N‑1)的错误读码框纠正为(3N)恢复通读gRNA；敲除DMD基因27号外显子的gRNA；以及跳跃DMD基因27号外显子，使外显子26和28连在一起恢复通读的gRNA。本发明能较全面地对DMD基因27号外显子进行基因编辑，利用特定的CRISPR‑SaCas9、CRISPR‑SauriCas9小体积系统，有利于实现单载体递送，将来更易应用到临床；而且能为DMD非热点突变的患者制备个性化基因编辑药物。

技术领域

本发明涉及基因编辑领域，尤其涉及一种用于治疗杜氏肌营养不良症的CRISPR-Cas9系统。

背景技术

遗传性疾病的治疗一直是一个亟待解决的难题，随着生命科学的不断发展，基因治疗被受到广泛的关注，尤其是CRISPR-Cas9的发现。由于CRISPR-Cas9技术其对基因组编辑方面的简洁和高效的优点，为很多遗传疾病的治疗带来了希望，该技术的应用得到了突飞猛进的发展，随着越来越多基因治疗药物的上市，为无数患者家庭带来希望，对人权的尊重、维护社会稳定，个性化治疗也成了必然趋势。但是目前多数上市的基因治疗药物多为国外开发，让技术不成为卡脖子的事情，保护我国病人享受治疗的权力，需加快对罕见病的治疗。

杜氏肌营养不良(DMD)是最常见的遗传性儿童肌病，在新生男孩中大约有1/3500患病，患者逐渐表现出进行性肌肉退化和虚弱，并因呼吸和心脏衰竭而过早死亡。绝大多数患者是因为编码肌营养不良蛋白的DMD基因发生突变，DMD基因位于X染色体上。DMD基因的突变主要包括大片段缺失，重复突变，点突变等，不同的突变类型表型也不相同。临床报告一部分患者基因突变集中在“热点突变区域”，也有很多患者突变在非热点区域。长久以来，国内外均无针对DMD的有效临床干预措施或药物。

研究者正在开发能够有效治疗DMD的药物，主要包括通过基因递送、外显子跳跃、终止密码子通读和基因组编辑疗法来恢复部分功能性肌萎缩蛋白的表达，以及通过靶向DMD发病机制中涉及的途径来改善肌肉功能和质量。2016年9月，美国FDA通过加快审批方式(仅进行了12例临床试验)批准了Sarepta Therapeutics公司的新药Exondys 51(Eteplirsen)注射液，该药是世界上第一款被批准用于治疗DMD的药物而Eteplirsen注射液只能针对Dys基因第51号外显子缺失的患者(约占DMD患者的13％)，且目前尚无足够的证据证明eteplirsen对DMD的治疗效果，并且Dys基因的突变多集中在2-20号外显子区和45-53号外显子区。因此Sarepta Therapeutics公司还在开发另外7种外显子跳跃产品，它们通过跳过53、45、50、44、52、55和8号外显子治疗其他基因突变型的DMD患者，在外显子跳跃疗法、终止密码子的修复方式，已有药物上市，但仅适用一部分患者，价格昂贵，并且需要反复给药。

基因编辑技术CRISPR-Cas9的出现可以实现精确的基因编辑，提高基因的修复效率，为很多遗传疾病带来希望，但利用CRISPR-Cas9技术也会有很多无法避免的问题，递送方式是主要考虑问题之一，由于CRISPR-Cas9系统比较大，因此大部分只能采用AAV递送，而AAV的成本高并且体内存在很多预存抗体，无法进行第二次注射；另外Cas9会引起体内的免疫反应，极大的影响了治疗效果。因此还需要不断的优化系统以及递送方式，所以现在有很多小的基因编辑系统被开发，例如CRISPR-SaCas9、CRISPR-SauriCas9，实现单载体递送,增加临床安全性。

目前对DMD疾病治疗主要集中在对热点突变病人的研究，而非热点突变的病人也很多，并且随着科学技术的进步，将来实现基因个性化治疗成为趋势，因此针对非热点突变的DMD病人，制备CRISPR-Cas9基因药物很有必要。

发明内容