[发明专利]腺病毒包装用系统、应用及腺病毒包装方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，公开了一种腺病毒包装用系统、应用及腺病毒包装方法。本发明的腺病毒包装用系统包括表达载体、供体质粒和腺病毒；所述表达载体能够表达Cas9、sgRNA1、sgRNA2；所述供体质粒由5’‑3’端依次含有反向末端重复序列、包装信号、启动子和目的基因；所述腺病毒基因组含有外源基因表达盒；sgRNA1的识别位点位于腺病毒的基因组的5’端的反向末端重复序列和包装信号之间；sgRNA2的识别位点位于(a)腺病毒基因组所携带外源基因表达盒的启动子和终止信号之间，以及(b)供体质粒的目的基因的3’端。使用本发明的腺病毒包装系统进行腺病毒包装操作步骤简单，病毒包装时间短，病毒效价高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种腺病毒包装用系统、应用及腺病毒包装方法。

背景技术

腺病毒是一种大分子(36kb)双链无包膜DNA病毒。重组腺病毒载体具有广泛的应用，例如作为载体其可以高效运输、表达目的基因。经过一系列改造后的第二代腺病毒可包装达到8kb的外源基因。第三代载体缺失了全部的或大部分腺病毒基因，仅保留ITR和包装信号序列，最大可插入35kb的基因，病毒蛋白表达引起的细胞免疫反应进一步减少，载体中引入核基质附着区基因可使得外源基因保持长期表达，并增加了载体的稳定性。因而，腺病毒载体在基因治疗临床试验和疫苗的开发方面有了越来越多的应用，成为继逆转录病毒载体之后广泛应用且最具前景的病毒载体。

目前腺病毒包装主要有三种包装方案，一种是较为传统的AdEasy，需要在大肠杆菌中重组，获得重组后的大载体，重组质粒经过质粒提取、酶切线性化、纯化等多个步骤转染HEK293细胞获得重组腺病毒。第二种为利用Infusion分子克隆技术将目的基因和包含腺病毒骨架的质粒直接连接转化大肠杆菌细胞获得重组质粒，重组质粒经过质粒提取、酶切线性化、纯化等多个步骤转染HEK293细胞获得重组腺病毒。第三种是AdMax系统，在体内利用Cre/loxp酶，将穿梭载体和病毒骨架载体在HEK293细胞利用位点特异性重组的方式，特点是操作方便，直接两个载体共转染HEK293即可。然而，前两种方法需要将目的基因克隆到病毒骨架载体上，由于病毒骨架质粒比较大(约34kb)，对分子克隆技术要求较高，克隆效率比较低而且大质粒在大肠杆菌中不稳定容易突变、全质粒测序验证工作量大、成本比较高，通常采用多挑取克隆的方法进行筛选稳定的质粒，另外大质粒提取、纯化困难。尽管AdMax系统不涉及复杂的分子克隆但需要制备病毒骨架载体质粒，而且大质粒制备困难依然存在，同时AdMax是出毒周期较长，通常需等待发生在转染后10～12天以上才能观察到空斑的形成。

CN109943591A公开了一种快速构建腺病毒的方法，该方法本质是将传统的AdEasy与Gibson Assembly技术相结合，将目的基因构建到穿梭质粒上，然后再将穿梭质粒与病毒骨架质粒利用Gibson Assembly分子克隆技术获得重组质粒。但是，该技术类似Infusion克隆技术，同样需要重组质粒经过质粒提取、酶切线性化、纯化等多个步骤转染HEK293细胞获得重组腺病毒，也同样存在克隆效率比较低、大质粒在大肠杆菌中不稳定容易突变、全质粒测序验证工作量大、成本比较高，大质粒提取、纯化困难等问题。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的出毒周期长、相关技术要求高、效率低等问题，提供一种腺病毒包装用系统、应用及腺病毒包装方法。使用本发明的腺病毒包装系统进行腺病毒包装操作步骤简单，病毒包装时间短，病毒效价高。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种腺病毒包装用系统，其特征在于，所述系统包括表达载体、供体质粒和腺病毒；

其中，所述表达载体能够表达Cas9、sgRNA1、sgRNA2；

所述供体质粒由5’-3’端依次含有反向末端重复序列、包装信号、启动子和目的基因，并且不含有转录终止信号；

所述腺病毒基因组含有外源基因表达盒；

所述sgRNA1的识别位点位于腺病毒的基因组的5’端的反向末端重复序列和包装信号之间；