[发明专利]一种脱细胞基质构建组织工程血管化牙髓的方法及应用

权利要求书

1.一种脱细胞基质构建组织工程血管化牙髓的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、大鼠颌下腺脱细胞处理得到脱细胞颌下腺基质；

S2、将所述脱细胞颌下腺基质冻干得到冻干支架；

S3、将所述冻干支架体外接种牙髓干细胞得到牙髓干细胞-支架复合体；

S4、将所述牙髓干细胞-支架复合体与牙根切片构建组织工程复合体。

2.根据权利要求1所述的一种脱细胞基质构建组织工程血管化牙髓的方法，其特征在于，所述S1中大鼠颌下腺脱细胞处理包括以下步骤：将颌下腺经去离子水、表面活性剂多次洗涤后酶消，并再次洗涤，灭菌后备用。

3.根据权利要求1所述的一种脱细胞基质构建组织工程血管化牙髓的方法，其特征在于，所述S2中脱细胞颌下腺基质冻干包括以下步骤：将脱细胞颌下腺基质洗涤后经培养基浸泡，进行预冻、冷冻干燥，得到冻干支架。

4.根据权利要求3所述的一种脱细胞基质构建组织工程血管化牙髓的方法，其特征在于，所述预冻时温度为-80℃，时间为2h，所述冷冻干燥时真空压力为0.07mbar，冷阱温度为-51℃，时间为24h。

5.根据权利要求1所述的一种脱细胞基质构建组织工程血管化牙髓的方法，其特征在于，S3前还包括将牙髓干细胞进行原代培养和传代培养；

所述原代培养时所用培养基为补充有20％FBS、100units/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素B和2mM L-谷氨酰胺的α-MEM培养基；

所述传代培养时所用培养基为补充有10％FBS、100units/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.25μg/ml两性霉素B和2mM L-谷氨酰胺的α-MEM培养基。

6.根据权利要求5所述的一种脱细胞基质构建组织工程血管化牙髓的方法，其特征在于，所述原代培养包括以下步骤：将牙髓组织用缓冲液洗涤后切割、酶消、制备单细胞悬液，离心，得到细胞沉淀，于所述原代培养基中进行培养；所述酶消时所用酶溶液为补充有3mg/ml I型胶原酶、4mg/ml分散酶的PBS溶液。

7.根据权利要求5所述的一种脱细胞基质构建组织工程血管化牙髓的方法，其特征在于，所述传代培养包括以下步骤：原代细胞生长融合至覆盖80％瓶底壁表面时，吸出培养基并洗涤，加入胰蛋白酶37℃消化2min后，加入传代培养基终止消化，离心，得到细胞沉淀，于传代培养基中进行传代培养。

8.根据权利要求1所述的一种脱细胞基质构建组织工程血管化牙髓的方法，其特征在于，所述S3体外接种牙髓干细胞包括以下步骤：将传代培养后的P3细胞生长融合至80％时，经胰蛋白酶消化，重悬于培养基中，滴加至所述冻干支架上进行细胞培养，得到牙髓干细胞-支架复合体。

9.根据权利要求8所述的一种脱细胞基质构建组织工程血管化牙髓的方法，其特征在于，所述S4构建组织工程复合体包括以下步骤：将牙根切片脱矿处理，得到脱矿处理后的牙根切片，将所述牙髓干细胞-支架复合体培养后，放置于脱矿处理后的牙根切片的扩大根管内。

10.根据权利要求9所述的一种脱细胞基质构建组织工程血管化牙髓的方法，其特征在于，所述脱矿处理具体为：依次使用17％EDTA、10％EDTA、5％EDTA进行脱矿处理，每次脱矿处理后需超声下去离子水洗；所述培养具体为：在37℃、含5％CO₂的条件下培养3d。