[发明专利]一种狐、貉肺炎三联灭活疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种狐、貉肺炎三联灭活疫苗，其特征在于：包括抗原和常规疫苗佐剂，所述抗原包括狐、貉源大肠杆菌DC176-2株，保藏编号为CGMCC No:25233、肺炎克雷伯菌FY170-1株，保藏编号CGMCC No:25234、奇异变形杆菌QY23-1株，保藏编号CGMCC No:25235；保藏日期：2022年7月4日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.根据权利要求1所述一种狐、貉肺炎三联灭活疫苗，其特征在于：所述狐、貉源大肠杆菌DC176-2株的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。

3.根据权利要求1所述一种狐、貉肺炎三联灭活疫苗，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌FY170-1株的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID No.2所述。

4.根据权利要求1所述一种狐、貉肺炎三联灭活疫苗，其特征在于：所述奇异变形杆菌QY23-1株的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID No.3所述。

5.根据权利要求1所述一种狐、貉肺炎三联灭活疫苗，其特征在于：所述三联灭活疫苗应用于预防由狐、貉大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌三种病原菌引发的狐、貉肺炎。

6.根据权利要求1所述一种狐、貉肺炎三联灭活疫苗，其特征在于：所述疫苗中灭活前的各细菌浓度均不少于5×10⁷CFU/mL。

7.根据权利要求1所述一种狐、貉肺炎三联灭活疫苗，其特征在于：所述大肠杆菌DC176-2株、肺炎克雷伯菌FY170-1株、奇异变形杆菌QY23-1株比例为1∶1∶1。

8.根据权利要求1所述一种狐、貉肺炎三联灭活疫苗，其特征在于：所述抗原均使用甲醛灭活。

9.根据权利要求1所述一种狐、貉肺炎三联灭活疫苗，其特征在于：所述佐剂为氢氧化铝胶佐剂。

10.如权利要求1所述一种狐、貉肺炎三联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：

第一步：制备大肠杆菌DC176-2株、肺炎克雷伯菌FY170-1株、奇异变形杆菌QY23-1株灭活抗原；

(1)、大肠杆菌DC176-2株、肺炎克雷伯菌FY170-1株、奇异变形杆菌QY23-1株的培养：分别将冻存的大肠杆菌DC176-2株、肺炎克雷伯菌FY170-1株、奇异变形杆菌QY23-1株经复苏、平板划线活化后，挑取单菌落接种至LB液体培养基的试管中，37℃摇床培养12-18h得到种子液，而后按1％的体积比接种至三角瓶中，培养至对数生长期；

(2)、大肠杆菌DC176-2株、肺炎克雷伯菌FY170-1株、奇异变形杆菌QY23-1株的灭活：将对数生长期的大肠杆菌DC176-2株、肺炎克雷伯菌FY170-1株、奇异变形杆菌QY23-1株培养液中分别加入0.075％、0.3％、0.075％的甲醛溶液，恒温摇床37℃120rpm的转速下，分别灭活16h、22h、16h制得抗原液，分别将灭活后的大肠杆菌DC176-2株、肺炎克雷伯菌FY170-1株、奇异变形杆菌QY23-1株用pH＝7.4的PBS洗涤三次后用PBS重悬浮，调整菌液浓度至5×10⁷CFU/mL；

(3)、安全性检查：分别取100μL灭活后的菌液涂布于LB平板培养24h，观察是否有菌落生长，进行安全性检验，检验合格后置于4℃保存，备用；

第二步，配制疫苗：将三种灭活离心后检验合格的菌液1∶1∶1等量混合，取混合后的菌液再与10％氢氧化铝胶佐剂混合，充分搅拌均匀，根据产品规格进行分装，即得到所述狐、貉肺炎三联灭活疫苗。