[发明专利]一种指示猪体细胞克隆胚胎基因组激活程度的载体及细胞

说明书

本发明公开了一种指示猪体细胞克隆胚胎基因组激活程度的载体及细胞，涉及哺乳动物体细胞克隆技术领域。该载体插入有指示猪胚胎基因组激活程度的报告系统，包括猪PRD‑Like同源域转录因子的DNA结合基序(PRDL‑motif)、迷你启动子、红色荧光蛋白mCherry编码框、SV40poly(A)信号以及酶切位点。使用该载体可以筛选到基因组插入上述报告系统的阳性细胞，以该细胞作为供体细胞进行猪体细胞克隆胚胎的构建，得到的克隆胚胎在体外培养过程中可以通过荧光强度指示猪体细胞克隆胚胎的基因组激活程度，因此该细胞可以用于在植入前阶段筛选优质克隆胚胎进行胚胎移植和克隆猪制备。

技术领域

本发明属于哺乳动物体细胞克隆技术领域，具体涉及一种根据胚胎的荧光发光强度指示猪体细胞克隆胚胎基因组激活程度的载体及细胞。

背景技术

体细胞克隆技术是一项应用于家畜胚胎工程领域和再生医学领域的重要技术，可应用于家畜育种保种、开发疾病模型、生产器官移植供体、保护濒危物种、生产转基因动物等。然而，通过体细胞克隆技术获得的胚胎在植入前阶段囊胚发育率低，植入后常发生流产、死胎等异常情况，导致克隆动物整体出生效率仍然不高。

目前认为，哺乳动物克隆效率低下的原因之一是克隆胚胎存在基因组激活失败的现象，绝大多数研究聚焦该问题，对克隆胚胎进行小分子抑制剂处理或显微注射调控因子的核酸片段等方法，达到了提高克隆动物出生效率的目的。然而，目前仍缺少一种能够即时指示克隆胚胎基因组激活程度的方法，以便在植入前阶段筛选出基因组激活正常的优质克隆胚胎，以此提高胚胎移植的准确性和克隆动物的出生效率。

因此，提供一种指示猪体细胞克隆胚胎基因组激活程度的载体及细胞是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提出一种根据胚胎的荧光发光强度指示猪体细胞克隆胚胎基因组激活程度的载体及细胞。使用这一载体可以将指示猪胚胎基因组激活程度的报告系统插入供体细胞基因组，再利用该供体细胞构建猪克隆胚胎，体外培养72h后可根据荧光发光强度对克隆胚胎进行分选，由此筛选基因组激活正常的优质克隆胚胎进行胚胎移植和克隆猪制备。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现：

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种指示猪体细胞克隆胚胎基因组激活程度的载体，该载体插入含有指示猪胚胎基因组激活程度的报告系统；

所述的报告系统含重复6次的猪PRD-Like同源域转录因子的DNA结合基序(PRDL-motif)，一共89bp，核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

进一步的，报告系统还在PRDL-motif下游添加了迷你启动子、红色荧光蛋白mCherry编码框、SV40 poly(A)信号以及XhoI酶切位点，上游添加了SwaI酶切位点，一共1111bp，整体核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

一种指示猪体细胞克隆胚胎基因组激活程度的细胞，该细胞基因组Rosa26位点插入有指示猪胚胎基因组激活程度的报告系统。

进一步的，以该细胞作为供体细胞进行猪体细胞克隆胚胎的构建，得到的克隆胚胎培养72h后，在波长为587nm激发光下会发出红色荧光，荧光发光强度越强，指示猪体细胞克隆胚胎基因组激活程度越高，其发育至囊胚期的能力也越强。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1.本发明提供的一种根据胚胎的荧光发光强度指示猪体细胞克隆胚胎基因组激活程度的载体及细胞，与未经处理的正常猪耳成纤维细胞相比，利用插入报告系统的供体细胞构建克隆胚胎的2细胞率、4细胞率及囊胚率无显著差异，说明使用该细胞不影响猪克隆胚胎的常规发育。