[发明专利]检测四环素治疗幽门螺杆菌感染的耐药基因16S RNA突变情况的引物、试剂盒和方法

说明书

本发明公开了一种检测四环素治疗幽门螺杆菌感染的耐药基因16S RNA的引物和方法，其包括扩增检测幽门螺杆菌全长16S RNA的5对引物；采用PCR扩增技术和Sanger测序技术。本发明可快速地将幽门螺杆菌全长16S RNA的突变情况检测出来，并可根据突变情况判断其氨基酸的改变，从而确定是否可以用四环素治疗幽门螺杆菌感染。利用本发明完成的检测结果准确，在幽门螺杆菌感染治疗时，可结合患者的16S RNA突变情况实施个体化治疗方案。

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测四环素治疗幽门螺杆菌感染的耐药基因16S RNA突变情况的引物、试剂盒和方法。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobactor pylori,简称Hp)是一种专性寄生于人胃黏膜上的革兰阴性细菌。1979年由罗宾·沃伦发现，1981年被巴里·马歇尔成功从胃活检组织中分离。它是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌，可在微需氧环境下生存，环境氧要求为5～8％。它是目前所知能够在人胃中生存的唯一微生物种类。该菌主要生长于胃粘液深层，胃黏膜表面等。它主要经粪口途径传播。

幽门螺杆菌的感染范围十分广泛。据统计，初次感染幽门螺杆菌年龄较早的人群萎缩性胃炎及胃癌发生率高，幽门螺杆菌感染与胃癌死亡率的高低呈现平行关系。其临床症状普遍为：食后上腹部饱胀、不适或疼痛，常伴有其他不良症状，如嗳气、腹胀、反酸和食欲减退等。有些患者还可出现反复发作性剧烈腹痛、上消化道少量出血等。针对幽门螺杆菌的检测方法主要包括侵入性检测、非侵入性检测以及Hp生物芯片检测等三类。其中幽门螺杆菌的培养、胃黏膜涂片及革兰染色镜检、组织切片染色镜检、¹⁵N尿氨排出试验、粪便Hp抗原检测、血清学及尿液Hp抗体检测等临床上较为常见。

目前幽门螺杆菌感染后的治疗标准治疗方法是采用四联疗法，即同时使用4种药物，主要包括2种抗生素、1种质子泵抑制剂和1种铋剂。其中，抗生素一般在阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、喹诺酮类、呋喃唑酮类、四环素中选择2种。质子泵抑制剂则一般在奥美拉唑、雷贝拉唑、艾司奥美拉唑、兰索拉唑中选择1种。铋剂一般在胶体果胶铋、枸橼酸铋钾中选择1种。

四环素类药物主要是由放线菌素产生的一类具有氢化骈四苯环结构的广谱抗生素，根据来源可以分为天然品和半成品两类。目前临床上主要使用的天然品有四环素，半成品有米诺环素、多西环素等，还包括金霉素、土霉素、美他环素等。它们的作用机制主要是通过药物与细菌的核蛋白体30S亚基在A位特异性结合，从而阻止氨基酸-tRNA在该位置上的联结，进而抑制始动复合物的形成以及肽链复合物的延伸，并阻止终止密码子与核糖体结合，使已合成的肽链或蛋白不能释放，起到抑菌作用。

但随着越来越多的抗生素被广泛使用，Hp耐药现象变得日趋严重，严重影响其临床疗效和根除率。即使应用推荐的标准治疗方案，也有10％～30％的患者持续有Hp感染。

四环素类药物的耐药性包括多方面的原因。但最主要的原因是幽门螺杆菌耐药基因16SrRNA的突变。其耐药突变主要在helix31处，该区域含有四环素的主要或第一结合位点。目前研究已发现的耐药主要与位点926-928AGA突变为TTC相关。

因此，在抗幽门螺杆菌感染治疗时，结合患者16S RNA基因突变情况，判断耐药问题实施个体化治疗方案：治疗时是否使用四环素，以及四环素的用量作出精确判断，减少药物不良反应，提高治疗效果。

发明内容

本发明的目的是提供一种四环素治疗幽门螺杆菌感染的耐药基因16S RNA突变情况的引物，采用PCR技术，可用于快速检测幽门螺杆菌感染患者的四环素耐药基因16S RNA突变情况并判断患者对四环素的耐药情况。

检测四环素治疗幽门螺杆菌感染的耐药基因16S RNA突变情况的引物，其特征在于所使用的扩增引物和测序引物为：

SEQ1-F：TGTAAAACGACGGCCAGTACGCATAGGTCATGTGCCTC