[发明专利]一种单拷贝VGF基因溶瘤痘苗病毒载体的构建方法及应用

权利要求书

1.一种单拷贝VGF基因溶瘤痘苗病毒载体的构建方法，其特征在于，所述溶瘤痘苗病毒载体为痘苗病毒WR株，在缺失原有两个拷贝的VGF基因的基础上删除TK基因，并在TK区域插入单拷贝VGF基因序列，获得TK基因缺失的单拷贝VGF基因的溶瘤痘苗病毒载体。

2.如权利要求1所述的溶瘤痘苗病毒载体的构建方法，其特征在于，所述VGF基因为天然VGF基因或VGF基因变体。

3.如权利要求2所述的溶瘤痘苗病毒载体的构建方法，其特征在于，所述VGF基因变体为通过基因工程或蛋白质工程获得的变体，并保留天然VGF基因的活性。

4.如权利要求1-3任一项所述的溶瘤痘苗病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)参考序列：NCBIReferenceSequence:NC_006998.1，设计靶向TK区并含有VGF序列的穿梭载体；通过基因合成依次将TK基因的上游序列SEQ1、荧光蛋白RFP序列SEQ3、H5启动子SEQ4、VGF序列SEQ5、TK基因的下游序列SEQ2连接到质粒载体上，构建VGF穿梭载体pTK-VGF；

(2)根据TK基因序列，设计gRNA序列SEQ6，并将gRNA序列插入到PB-gRNA载体上，构建PB-gRNA-TK；

(3)将CV1细胞接种到六孔板，细胞达到90％以上的融合度时，同时转染Cas9和PB-gRNA-TK混合质粒，经过24小时后感染WRΔVGF，2小时后转染pTK-VGF；再经过48小时，收集上清和细胞的混合液，冻融3次，按5微升/孔加入铺满CV1细胞的六孔板中；48小时后，在荧光显微镜下挑取红色荧光的单克隆细胞；将单克隆溶液冻融后按5微升/孔加入铺满CV1细胞的六孔板中，48小时后再次挑取单克隆细胞，直至荧光显微镜下全部为红色荧光，即为痘苗病毒载体WRDD-VGF。

5.如权利要求4所述的构建方法得到的溶瘤痘苗病毒载体在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为实体瘤。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述实体瘤包括胰腺癌、结肠癌、肝癌或胃癌。