[发明专利]一种单拷贝VGF基因溶瘤痘苗病毒载体的构建方法及应用

说明书

本发明涉及一种肿瘤靶向性痘苗病毒载体WRDD‑VGF的构建方法及应用,该病毒载体是痘苗病毒WR株，删除原有两个VGF基因和J2R(TK)基因，并在TK区域插入单拷贝VGF基因序列，获得的TK基因缺失的单拷贝VGF基因的溶瘤痘苗病毒载体。本发明WRDD‑VGF具有靶向性、安全性、有效性的特点，具有肿瘤靶向性和抗肿瘤作用，可用于各种肿瘤的治疗，为溶瘤病毒药物研究提供一种新型的肿瘤靶向病毒骨架载体。

技术领域

本发明涉及一种单拷贝VGF基因溶瘤痘苗病毒载体的构建方法及应用，属于生物技术和基因治疗领域。

背景技术

近些年，痘苗病毒被广泛用作靶向肿瘤基因载体，由于痘苗病毒具有强大高效的复制转导能力、能够接纳外来基因的巨大能力、广谱的肿瘤细胞感染能力、其基因组DNA不会与宿主DNA整合，且在天花根除计划中具有出色的安全记录，很少出现严重的不良反应。相对于其他种类的病毒，痘苗病毒在作为溶瘤剂应用肿瘤的过程中可以静脉注射，可以进行远端给药解决了临床上给药困难的问题。

痘苗病毒(Vaccinia virus,VV)WR株在动物模型中显示很强的毒性，而且具有固有的肿瘤选择性。WR株中含有两个VGF基因(痘苗病毒生长因子)序列，通过基因技术删除TK(并插入报告基因增强绿色荧光蛋白EGFP)和两个拷贝的VGF基因获得的vv-DD载体(CancerResearch,2001,61,8751–7，本文命名为WRDD)，具有与野生菌株相似的肿瘤杀伤作用，并表现出更为显著地肿瘤特异性复制作用。vv-DD已经进入临床试验，结果发现安全性很好，抗肿瘤能力有待提升。VGF是痘苗病毒C11R基因编码的产物。C11R基因是存在于WR株和其他正痘病毒中的早期基因，编码可溶性的分泌的痘苗病毒生长因子是一种与EGFR结合并刺激EGFR的蛋白质。C11R基因的缺失会降低痘苗病毒诱导的ERK2和NF-κB活化。序列分析表明VGF是痘苗病毒基因组中编码的多肽的加工形式，与表皮生长因子(EGF)和α转化生长因子(αTGF)有关。与EGF或αTGF不同，VGF是糖基化的，VGF与EGF受体结合并刺激其自身磷酸化。VGF在刺激未感染细胞的生长以促进病毒感染方面发挥重要作用。早期的技术只能使WR株的两个拷贝的VGF序列同时删除，VGF基因缺失使得痘苗病毒在细胞间的传播和使细胞病变的能力有所减弱。因此，需要开发一种靶向更有效性的溶瘤痘苗病毒载体。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种单拷贝VGF基因溶瘤痘苗病毒载体的构建方法及应用。该病毒载体能在体内和体外增强抗肿瘤能力，具有靶向性、安全性、有效性的特点。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种单拷贝VGF基因溶瘤痘苗病毒载体的构建方法，所述溶瘤痘苗病毒载体为痘苗病毒WR株，在缺失原有两个拷贝的VGF基因的基础上删除TK基因，并在TK区域插入单拷贝VGF基因序列，获得TK基因缺失的单拷贝VGF基因的溶瘤痘苗病毒载体。

所述的溶瘤痘苗病毒载体的构建方法，所述VGF基因为天然VGF基因或VGF基因变体。

所述VGF基因变体为通过基因工程或蛋白质工程获得的变体，并保留天然VGF基因的活性。

所述的溶瘤痘苗病毒载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)参考序列：NCBI Reference Sequence:NC_006998.1，设计靶向TK区并含有VGF序列的穿梭载体；通过基因合成依次将TK基因的上游序列SEQ1、荧光蛋白RFP序列SEQ3、H5启动子SEQ4、VGF序列SEQ5、TK基因的下游序列SEQ2连接到质粒载体上，构建VGF穿梭载体pTK-VGF；

(2)根据TK基因序列，设计gRNA序列SEQ6，并将gRNA序列插入到PB-gRNA载体上，构建PB-gRNA-TK；