[发明专利]一种高产西柏三烯一醇产量的工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种高产西柏三烯一醇的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶、甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸-5-磷酸激酶、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶、异戊烯焦磷酸异构酶、法尼基焦磷酸合成酶、牻牛儿基焦磷酸合成酶、六磷酸葡萄糖内酯酶和西柏三烯一醇合成酶，出发的宿主菌为大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶是基因mvaE编码，GenBank登录号为AAG02439.1；所述3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶是基因mvaS编码，GenBank登录号为AAG02438.1；所述甲羟戊酸激酶是基因ERG12编码，GenBank登录号为NM_001182715.1；所述甲羟戊酸-5-磷酸激酶是基因ERG8编码，GenBank登录号为NM_001182727.1；所述甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶是基因ERG19编码，GenBank登录号为X97557.1；所述异戊烯焦磷酸异构酶是基因IDI编码，GenBank登录号为NM_001183931.1；所述法尼基焦磷酸合成酶是基因Erg20编码，GenBank登录号为NM_001181600.1；所述牻牛儿基焦磷酸合成酶是基因CrtE编码，GenBank登录号为M87280.1；所述六磷酸葡萄糖内酯酶是基因pgl编码，GenBank登录号为NC_000913.3；所述西柏三烯一醇合成酶是基因CBTS2a编码，编码基因CBTS2a序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述基因工程菌的微生物制剂。

4.权利要求1或2所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)表达载体的构建：将乙酰辅酶A酰基转移酶基因/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS连接到质粒pET30a(+)上，得到重组质粒I；六磷酸葡萄糖内酯酶基因pgl、法尼基焦磷酸合成酶基因Erg20，牻牛儿基焦磷酸合成酶基因CrtE，西柏三烯一醇合成醇基因CBTS2a克隆到质粒pACYDuet-1上得到重组质粒II；

(2)突变菌株构建：将甲羟戊酸激酶基因ERG12、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1整合至大肠杆菌BL21(DE3)基因组内，得到含有四个基因的突变菌株I；

(3)重组菌转化：将步骤(1)所得重组质粒I与重组质粒II共同转化至步骤(2)所得到的突变菌株I所制备的感受态中，得到用于生产西柏三烯一醇的基因工程菌。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶是基因mvaE编码，GenBank登录号为AAG02439.1；所述3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶是基因mvaS编码，GenBank登录号为AAG02438.1；所述甲羟戊酸激酶是基因ERG12编码，GenBank登录号为NM_001182715.1；所述甲羟戊酸-5-磷酸激酶是基因ERG8编码，GenBank登录号为NM_001182727.1；所述甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶是基因ERG19编码，GenBank登录号为X97557.1；所述异戊烯焦磷酸异构酶是基因IDI编码，GenBank登录号为NM_001183931.1；所述法尼基焦磷酸合成酶是基因Erg20编码，GenBank登录号为NM_001181600.1；所述牻牛儿基焦磷酸合成酶是基因CrtE编码，GenBank登录号为M87280.1；所述六磷酸葡萄糖内酯酶是基因pgl编码，GenBank登录号为NC_000913.3；所述西柏三烯一醇合成酶是基因CBTS2a编码，基因CBTS2a序列如附件序列表SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

6.一种产西柏三烯一醇的方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述的基因工程菌在37℃条件下，至少发酵46小时。