[发明专利]一种高产西柏三烯一醇产量的工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开一种高产西柏三烯一醇产量的工程菌及其构建方法与应用，属于生物技术领域。为了实现高产量、高效率合成西柏三烯一醇，本发明将西柏三烯一醇合成酶基因CBTS2a克隆至表达载体，然后转化到含用MVA途径的GGPP高通量合成途径的工程菌中，得到生产西柏三烯一醇的基因工程菌。进一步通过表达可提高细胞还原力的六磷酸葡萄糖内酯酶，提高了西柏三烯一醇的合成能力。本发明的基因工程菌经发酵培养46h，西柏三烯一醇的产量可高达5073mg/L。本发明的基因工程菌可以直接从菌体中获得西柏三烯一醇，具有良好的工业应用潜力。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高产西柏三烯一醇产量的工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

西柏三烯一醇是由烟草叶面腺毛分泌的西柏烷类化合物。在烟叶烘烤调制和陈化过程中，西柏类化合物降解产生茄酮及衍生物等香味成分，是影响烟叶品质的重要成分。此外西柏三烯一醇对抵抗昆虫的侵袭具有良好的抗性，而且具备易于生物降解等特性，近年来作为生态友好且可快速生物降解的杀虫剂代表越来越受到人们的关注。同时，西柏三烯一醇也可以作为一些抗肿瘤、抗生素以及神经保护药物的前体物质。由于植物中含量较低，且存在较多官能化衍生物，大规模纯化生产西柏三烯一醇的技术难度较大，且成本高、效率低、对环境有较大污染。利用微生物合成法生产西柏三烯一醇，具有成本低、产量高、工艺简单、易于放大等优点，并且不受季节、气候条件的限制。模式微生物大肠杆菌，具有生长速度快，遗传背景清楚，易于分子操作等特点，是理想的宿住。

在烟草中，萜类代谢前体物IPP与DMAPP是由甲羟戊酸(MVA)代谢途径和丙酮酸/3-磷酸甘油醛代谢(MEP)合成。IPP与DMAPP在牻牛儿基焦磷酸缩合成GPP，然后再与2个IPP在牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)的作用下缩合成牻牛儿基焦磷酸(GGPP)。GGPP在西柏三烯一醇合成酶CBTS2a的作用下环化形成西柏三烯一醇。在大肠杆菌体内，IPP与DMAPP是通过MEP代谢途径合成，在法尼烯焦磷酸合成酶(FPPS)的作用下，DMAPP与2个IPP缩合形成C15骨架FPP，本身并不能合成GGPP，需要引入外源牻牛儿基焦磷酸合成酶(CrtE)催化形成GGPP。近年来，大部分文献报道，由于大肠杆菌本身MEP途径通量较低，通过需要引入异源MVA途径加强IPP与DMAPP的供应，可以极大的提高了萜类化合物的产量。Wolfgang Mischko等通过引入CBTS，同时过表达MEP途径中DXS与IDI两个关键酶，构建了一株可以生产西柏三烯一醇的菌株，最终在50L的发酵罐中发酵120h，产量达到78.9mg/L(Wolfgang Mischko,etal.Modular biomanufacturing for a sustainableproduction of terpenoid-basedinsect deterrents.Green Chemistry.2018,20,5374)。但是该工程菌仍然存在发酵周期长，产物产量低等问题。

在前期的工作中，我们首先在大肠杆菌内引入了外源的甲羟戊酸代谢途径，增加了萜类化合物前体物IPP与DMAPP的供应；然后，过表达了法尼基焦磷酸合成酶(Erg20)与牻牛儿焦基磷酸合成酶(CrtE)，从而使在大肠杆菌能够合成二萜类化合物的前体物质GGPP；进一步，我们引入了来自于烟草的西柏三烯一醇合成酶(CBTS2a),从而构建了完整的西柏三烯一醇合成途径。在摇瓶发酵实验中对工程菌株进行验证，通过气质色谱对目标产物进行定性，表明我们所构建的工程菌株能够合成西柏三烯一醇。在5L分批补料发酵罐实验中，发酵46小时后，西柏三烯一醇的产量达到了500mg/L。较文献报道的78.9mg/L提高了6.3倍，且发酵周期缩短了接近一倍(李依婷、张汝兵、程涛、咸漠、杨爱国、王元英.一种高产西柏三烯一醇的基因工程菌及其构建方法与应用[P].201911012486.X)。虽然我们构建的工程菌在产物的浓度以及单位时间产率都有所提升，但距工业化生产的要求还有一定的距离。因此，进一步对西柏三烯一醇的代谢途径进行优化，增加其代谢通量，提高柏三烯一醇的产量是我们亟待解决的问题。

发明内容