[发明专利]一种提高引导编辑系统碱基编辑效率的方法

说明书

本发明公开了一种提高引导编辑系统碱基编辑效率的方法。本发明为了进一步提高引导编辑系统的编辑效率，在PE‑P6引导编辑系统的基础上敲除了水稻MMR修复基因，得到引导编辑系统PE‑P6^ΔOsMLH1RT‑S和引导编辑系统PE‑P6^ΔOsMLH1RT‑M。与PE‑P6引导编辑系统相比，敲除OsMLH1基因后，引导编辑系统PE‑P6^ΔOsMLH1RT‑S和PE‑P6^ΔOsMLH1RT‑M能够进一步提升靶点的编辑效率；并且引导编辑系统PE‑P6^ΔOsMLH1RT‑M能够最大程度地提高水稻靶点的编辑效率。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高引导编辑系统碱基编辑效率的方法。

背景技术

2019年，David Liu实验室新开发的一种多功能基因组编辑技术，即引导编辑(Prime editing，PE)，该技术可以在不需要双链DNA断裂或供体DNA模板的情况下，精确实现12种类型的碱基替换、小的插入和缺失。PE系统的最小组成是一个Cas9切刻酶(Cas9nickase，Cas9n)与莫洛尼小鼠白血病病毒逆转录酶(M-MLV reverse transcriptase，M-MLV RT)，以及一个引导编辑的向导RNA(prime editing guide RNA，pegRNA)。pegRNA包含一个指定目标位点的间隔区域、一个单导RNA(single-guide RNA，sgRNA)支架和一个3’延伸。其中3’延伸包含一个与DNA间隔区域的一部分互补引物结合位点(primer bindingsite，PBS)，以及一个编码所需的编辑和下游基因组序列RT模板。2021年，一种工程化的pegRNA(engineered pegRNA，epegRNA)将结构化的RNA基序整合到pegRNA的3’端，将人类细胞中的引导编辑效率提高了3～4倍。

植物中大多数靶位点的PE编辑效率远低于人类细胞中20％～70％的编辑效率。近年来，主要包括优化PE成分在内的多项工作已被用于进一步提高引导编辑在作物中的应用。例如，利用多顺反子tRNA和核糖酶促进pegRNA在玉米中的表达，在水稻中引入与N端逆转录酶-cas9n融合蛋白协同的RT模板进行多核苷酸替换，以及在水稻和小麦中去除M-MLVRT的核糖核酸酶H结构域并加入具有核酸伴侣蛋白活性的病毒核衣壳蛋白，均可增加PE的灵活性和适用性。然而，经过上述各项改进后，在稳定的转基因植株中，PE的平均效率依然不高。如何提高PE的效率，尤其是在农作物的稳定转化层面上仍具有挑战性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种成套系统。

所述成套系统包括融合蛋白、esgRNA和pegRNA；

所述融合蛋白依次包括反转录酶、Cas9切刻酶、自切割寡肽和筛选标记蛋白；

所述esgRNA靶向MLH1基因靶点序列；

所述pegRNA依次包括esgRNA’、逆转录模板序列(RT序列)、引物结合位点序列(PBS序列)、连接序列和tevopreQ1基序；所述esgRNA’靶向目标基因靶点序列。

上述成套系统中，所述esgRNA依次由MLH1基因靶点序列和esgRNA骨架组成。

进一步的，所述esgRNA为带有tRNA的esgRNA，所述tRNA为将序列12第1-77位中的T替换为U后得到的RNA分子。所述esgRNA骨架为将序列7第11368-11453位中的T替换为U后得到的RNA分子。

所述esgRNA的个数可为1个或2个或多个。

所述MLH1基因序列如序列13所示。

更进一步的，所述esgRNA为2个，分别记作esgRNA1和esgRNA2，所述esgRNA1中的靶点序列如序列12第78-97位所示，所述esgRNA2中的靶点序列如序列12第261-280位所示。