[发明专利]一种WTX及其截短子重组蛋白的表达和纯化方法及其在相分离实验中的应用

权利要求书

1.一种WTX及其截短子重组蛋白表达与纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)WTX及其截短子重组蛋白表达；

(2)WTX及其截短子的纯化，其中，在纯化过程中采用的细胞裂解液组成包括Nativebinding buffer缓冲液、溶菌酶、蛋白酶抑制剂、DNase I、Triton X-100、NP-40、RNaseA。

2.如权利要求1所述的一种WTX及其截短子重组蛋白表达与纯化的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体操作为：

制备his WTX和/或his WTX截短子重组蛋白，分别接种于LB(Kan+)培养基中，置于摇床，进行培养过夜，接种过夜后的菌于LB(Kan+)中，继续培养，当OD600达到0.6-0.8时，加入IPTG至0.5mM，调整摇床转速，低温诱导重组蛋白表达，收集菌体沉淀，保存至冰箱中；

优选，摇床温度为37℃，培养的转速为200rpm，接种比例为1：50，继续培养时间为6-7h，调整摇床转速至180rpm，所述低温诱导重组蛋白表达的条件为：温度16℃，时间16-17h，冰箱的温度为-80℃。

3.如权利要求1所述的一种WTX及其截短子重组蛋白表达与纯化的方法，其特征在于，所述步骤(2)中Native binding buffer缓冲液、溶菌酶、蛋白酶抑制剂、DNase I、TritonX-100、NP-40、RNase A的体积比为1mL：10uL：40uL：1uL：5uL：5uL：1μL，所述溶菌酶的浓度为100mg/mL，所述DNase I的浓度为5μg/mL，所述RNase A的浓度为10μg/mL，所述蛋白酶抑制剂包括罗氏蛋白酶抑制剂，优选包括罗氏蛋白酶抑制剂25X。

4.如权利要求1所述的一种WTX及其截短子重组蛋白表达与纯化的方法，其特征在于，所述步骤(2)的具体操作为：

(a)配置细胞裂解液，取菌体沉淀，复溶后加入1ml PBS重悬菌体，平分为4管，离心，去除全部上清液，将细菌重新悬浮于1ml的细菌裂解液中，室温放置，冰上孵育，对溶液进行若干次超声破碎，每次脉冲之间有20-25秒的冷却期，再次离心，将上清液转移至EP管中，得到细菌蛋白裂解液；

优选，离心的条件为：温度4℃，转速4000g，时间6min；室温放置的时间为20-25min，冰上孵育的时间为30min，再次离心的条件为：温度4℃，转速12000rpm，时间15-20min；

(b)取Ni²⁺-NTA填料至新的柱子中，加6个体积超纯水洗填料，再Native bindingbuffer缓冲液洗填料，得到预处理好的Ni²⁺-NTA柱子；

优选，6个体积超纯水洗填料2次，Native binding buffer缓冲液洗填料2次；

(c)将上述步骤(a)得到的细菌蛋白裂解液加入到上述步骤(b)预处理好的Ni²⁺-NTA柱子，盖好盖子，采用翻转仪翻转；

优选，所述翻转的条件为：温度4℃，时间1h；

(d)加入6个体积的添加有罗氏蛋白酶抑制剂的Native wash buffer缓冲液洗柱子8-10次；优选，罗氏蛋白酶抑制剂与Native wash buffer缓冲液的体积比为1mL:10μL，罗氏蛋白酶抑制剂为25X罗氏蛋白酶抑制剂；

(e)加入添加有蛋白酶抑制剂的Native elution buffer缓冲液中洗脱，翻转仪翻转，将柱子固定在垂直位置，收集洗脱液，洗脱液中加入DTT，继续加Native elution buffer缓冲液洗脱，重复至全部洗脱，获得WTX和/或其截短子重组蛋白；

优选，蛋白酶抑制剂为1x罗氏蛋白酶抑制剂，翻转的条件为：温度4℃，时间10min；所述DTT的加入量为1μl，浓度1M；重复的次数为3次。