[发明专利]一种WTX及其截短子重组蛋白的表达和纯化方法及其在相分离实验中的应用

说明书

本发明一种WTX及其截短子重组蛋白的表达和纯化方法及其在相分离实验中的应用，属于重组蛋白表达与纯化技术领域。该表达和纯化方法包括：(1)WTX及其截短子重组蛋白表达；(2)WTX及其截短子的纯化，其中，在纯化过程中采用的细胞裂解液组成包括Native binding buffer缓冲液、溶菌酶、蛋白酶抑制剂、DNase I、Triton X‑100、NP‑40、RNase A。本发明为WTX蛋白的纯化提供一个快速高效简便的纯化方法，获得纯度高、生物学活性好的WTX蛋白。

技术领域

本发明属于重组蛋白表达与纯化技术领域，具体涉及一种WTX及其截短子重组蛋白的表达和纯化方法及其在相分离实验中的应用。

背景技术

蛋白质是生命功能的执行者，是生命活动的物质基础，也是生物体内的功能性大分子。要充分研究蛋白质的功能和结构，首先要得到高纯度的、具有生物学活性的、相对稳定的目的蛋白质，然后才能对其进行三维结构分析，制备相应靶向药物，进而大规模生产应用，造福人类。蛋白质在组织或细胞中通常是以复杂的混合物的形式存在，因此需要蛋白质纯化方法来获得单一且具有生物学活性的蛋白质。

WTX(Wilms Tumor gene on the X chromosome)，又名FAM123B或AMER1，位于Xq11.1，外显子全长7.5kb，编码1135个氨基酸的蛋白质，蛋白质基本结构包括1个核定位区、两个卷曲螺旋区、1个富含脯氨酸区。WTX蛋白由于其结构的复杂性，并且蛋白质结构中存在着大量无序区(IDRs)，极易被蛋白酶水解，导致其纯化难度大，目前尚没有关于WTX重组蛋白表达和纯化的完整方案，以及用于液液相分离实验的方法。

WTX在Wilms中发生突变或转位失活，在儿童肝母细胞瘤和胚胎性横纹肌肉瘤中也存在WTX突变，WTX在人肾上皮细胞中与APC形成复合物参与WNT/β-catenin/APC信号通路的调控过程，促进β-catenin降解，稳定WNT信号通路；WTX还可以通过增强P53基因的乙酰化抑制肿瘤发生；WTX与转录共表达因子TRIM28相互作用，调节细胞分化和肿瘤发生；WTX丢失激活PI3K/AKT/mTOR通路，促进胃癌细胞增殖和侵袭。通过对多种肿瘤的WTX表达分析，发现WTX在多种肿瘤中表达缺失，这些研究表明WTX异常与多种肿瘤发生有关。

我们的研究发现，WTX可以抑制结直肠癌进展，WTX失活在结直肠癌肝转移过程中发挥重要作用；WTX失活，导致RhoGDIa与CDC42的结合关系破坏，引发CDC42从RhoGDIa上解离，使CDC42从GDP结合的非活性状态转化成GTP结合的活性状态，从而激活CDC42信号通路，激活其下游的MRCKa,LIMK1/2和Cofilin分子，形成CDC42及其下游MRCKa-LIMK-Cofilin信号通路的级联激活，引起细胞骨架蛋白重构、细胞极化及细胞移动能力增强，促进结直肠癌进展和肝转移。逆转WTX表达，可以明显抑制结直肠癌进展和肝转移。因此，纯化WTX蛋白，分析其蛋白质结构，制备相应的纳米靶向药物，并用于研究和治疗结直肠癌肝转移，具有较大的临床治疗价值和意义。

液-液相分离(Liquid-liquid phase separation,LLPS)：是细胞形成无膜细胞器的物理化学基础。通过相分离，细胞内分子可以实现特异性的聚集，从而在看似“拥挤而混乱”的细胞内部形成一定的秩序，并形成细胞内无膜细胞器，也叫生物分子凝聚体(Biomolecular condensates)。生物分子凝聚体参与了细胞内各种生命物质分子活动的过程，包括染色质结构、基因组稳定性、DNA损伤反应和修复、转录和信号转导。这些细胞过程的失调是癌症发生或进展的一个重要分子机制，大量的研究表明LLPS的形成和调节与肿瘤的恶性进展有关。此外，生物分子凝聚物会影响抗肿瘤药物的疗效，因此，调节LLPS过程可能是潜在的治疗癌症的新型疗法。