[发明专利]同时检测枸橼酸苹果酸钙中枸橼酸、L-苹果酸和D-苹果酸的方法

说明书

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种同时检测枸橼酸苹果酸钙中枸橼酸、L‑苹果酸和D‑苹果酸的方法。本发明测定方法包括以下步骤：配制枸橼酸、L‑苹果酸和D‑苹果酸检的混合对照品溶液，采用HPLC法进行检测，其中，色谱柱为Phenomenex3126(D)手性色谱柱；流动相为含醋酸铵的硫酸铜溶液‑异丙醇的混合液。本发明通过优化HPLC色谱条件，采用手性色谱柱不仅实现了L‑苹果酸和D‑苹果酸的拆分，还能同时检测枸橼酸苹果酸钙中枸橼酸、L‑苹果酸和D‑苹果酸含量，填补了现有技术的空白，同时可通过检测枸橼酸苹果酸钙中D‑苹果酸的含量来判断枸橼酸苹果酸钙的质量，为枸橼酸苹果酸钙的质量控制提供依据。

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种同时检测枸橼酸苹果酸钙中枸橼酸、L-苹果酸和D-苹果酸的方法。

背景技术

枸橼酸苹果酸钙，又名果酸钙，英文名:Calcium Citrate Malate(简称CCM)。CCM作为新一代的、风靡欧美等发达国家的优质钙源，它是将钙、柠檬酸和苹果酸按一定比例配合而形成的螯合物，现已成为美国、西欧和日本等国首选的高吸收性钙原料。

CCM在同类产品中钙含量适中而溶解性明显好于其他产品，其溶解度随pH的减小而增大，且在微碱性和近中性的环境下仍具有较好的溶解性。果酸钙在较宽pH值范围的高溶解性是与高吸收相关的重要特征。据吴正奇,凌秀菊.钙强化剂和钙强化食品的研究进展[J].食品工业科技,2001(04):81-82中指出，果酸钙的组成成分柠檬酸和苹果酸具有光学左旋结构(左旋结构是可以被生物膜所识别的具有光学活性的化合物结构)，且是体内三羧酸循环(TAC循环)的中间代谢产物，可以保证随柠檬酸和苹果酸在体内的氧化而缓慢地释放出钙离子。这一特性就导致了CCM具有高生物学吸收利用性。

由于具有左旋生理功能的L-苹果酸比外消旋的DL-苹果酸贵，而D-苹果酸是不具备生理功能的。国内上市的枸橼酸苹果酸钙片没有标明含有的苹果酸化学构型属于哪种构型，容易存在用D-苹果酸充当L-苹果酸的情形，这直接影响其功效。此外，虽然有相关文献报道了DL-苹果酸和枸橼酸测定，但是其只能测定总苹果酸的含量，无法获得L-苹果酸和D-苹果酸的结构比例和含量。如需获得L-苹果酸和D-苹果酸的结构比例和含量，还需要另外借助苹果酸对映体拆分方法，但相关苹果酸对映体拆分方法又只能拆分苹果酸，无枸橼酸测定的报道。因此，开发一种既能拆分枸橼酸苹果酸钙片中苹果酸对映体，又能同时检测枸橼酸、L-苹果酸和D-苹果酸含量的方法很有必要。

发明内容

本发明的目的是提供一种同时检测枸橼酸苹果酸钙中枸橼酸、L-苹果酸和D-苹果酸的方法，该方法溶液配制简单、操作方便、能有效拆分L-苹果酸和D-苹果酸，速度快、精度高，同时可用于枸橼酸苹果酸钙中枸橼酸、L-苹果酸和D-苹果酸的含量测定。

本发明提供一种同时检测枸橼酸苹果酸钙中枸橼酸、L-苹果酸和D-苹果酸的方法，包括配制枸橼酸、L-苹果酸和D-苹果酸检的混合对照品溶液，采用HPLC法进行检测，其中，色谱柱为Phenomenex 3126(D)手性色谱柱；流动相为含醋酸铵的硫酸铜溶液-异丙醇的混合液。

发明人最开始使用Phenomenex 3126(D)手性固定相色谱柱实现了安妥沙星和右旋安妥沙星的拆分。但研究过程发现仅仅使用含硫酸铜溶液-异丙醇作为流动相，拆分苹果酸对映体分析时间特别长，异丙醇浓度即使增加到色谱柱耐受最大比例时，D-苹果酸在60min也未出峰。而在硫酸铜溶液中添加醋酸铵可以使得D-苹果酸提前出峰。因此，发明人经过进一步对色谱条件进行优化，发现其不仅能拆分和检测枸橼酸苹果酸钙中的L-苹果酸和D-苹果酸，还能同时检测枸橼酸苹果酸钙中的枸橼酸，这刚好填补了同时检测枸橼酸苹果酸钙中枸橼酸、L-苹果酸和D-苹果酸含量的空白，可通过检测枸橼酸苹果酸钙中D-苹果酸的含量判断其质量。具体地，Phenomenex 3126(D)手性色谱柱的型号为250×4.6mm。

优选地，上述技术方案中，所述含醋酸铵的硫酸铜溶液中硫酸铜浓度为2.8mmol/L。