[发明专利]一种低聚糖脱支酶突变体及其在葡萄糖母液中的应用

说明书

本发明公开了一种低聚糖脱支酶突变体及其在葡萄糖母液中的应用，该低聚糖脱支酶突变体由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第219位缬氨酸突变为丙氨酸得到。本发明的低聚糖脱支酶突变体V219A，以一次母液、二次母液、色谱分离尾液为底物，产物中葡萄糖的百分含量分别为99.21％(一次母液)、98.89％(二次母液)及97.97％(色谱分离尾液)，比野生型低聚糖脱支酶产物中葡萄糖的百分含量增加2.86％、8.64％、28.67％。可见突变体V219A显著提高了葡萄糖母液中葡萄糖的百分含量，高产物纯度及底物转化率可以扩大母液利用范围，使其更具有工业应用价值。

技术领域

本发明涉及一种低聚糖脱支酶突变体及其在葡萄糖母液中的应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

葡萄糖(glucose)，有机化合物，分子式C₆H₁₂O₆，是自然界分布最广且最为重要的一种单糖，葡萄糖为无色晶体，有甜味但甜味不如蔗糖，葡萄糖很容易被吸收进入血液中，葡萄糖是生物体内新陈代谢不可缺少的营养物质。因此医院人员、运动爱好者以及平常人们常常使用它当作强而有力的快速能量补充。医学上，葡萄糖能加强记忆，刺激钙质吸收和增加细胞间的沟通。发酵工业上微生物的生长需要合适的碳氮比，葡萄糖作为微生物的碳源，是发酵培养基的主料。食品工业上葡萄糖经异构酶处理后可制造果糖，尤其是含果糖42％的果葡糖浆，其甜度同蔗糖，已成为当前制糖工业的重要产品。葡萄糖在工业上的应用也很广，在印染制革工业中作还原剂，在制镜工业和热水瓶胆镀银工艺中常用葡萄糖作还原剂。工业也可异构化为甘露糖(生产甘露糖醇原料)，山梨醇可进一步生成维生素C，被广泛应用于临床治疗，而且甘露醇15％在临床作为一种安全有效的降低颅内压药物，来治疗脑水肿和青光眼。

葡萄糖的工业生产，主要以淀粉为原料，采用酸法、酸酶法或双酶法，再经脱色、离交、浓缩、结晶、分离、干燥后制得。在结晶葡萄糖生产工艺中，葡萄糖通常使用降温结晶，从晶浆中通过离心分离出晶体后的剩余部分称为结晶葡萄糖母液。每100万吨结晶葡萄糖大约产生20万吨葡萄糖母液。一次分离产生产中纯度糖蜜按照一定的比例进行回配，有的企业采用母液单独一次、二次结晶，从而产生二次母液、三次母液。葡萄糖母液一般干物质DS值约55％，其中含葡萄糖约78％，二糖约13％，三糖及以上约10％，组分里面除了葡萄糖占多数，还有大量的异麦芽低聚糖组分。在结晶的过程中，会产生大量的母液难以形成规格化产品，主要以外卖为主。由于外卖量较大，价格偏低，影响了结晶糖的效益。尤其是在母液销售淡季，母液库存压力加大，从一定程度上影响了公司以玉米深加工为主的循环经济产业链的健康发展。就母液来说，目前除了直接低价外卖，还可以通过其它的渠道来处理母液，提高母液的利用价值，是保证玉米深加工为主的循环经济产业链健康发展亟待解决的问题。

由于葡萄糖的母液中仍有很多分子量较小的直链麦芽低聚糖和异麦芽低聚糖，采用能催化短链底物且能生成葡萄糖的酶处理母液，是进一步提高葡萄糖母液价值的方法，但天然存在的酶，不能同时催化直链麦芽低聚糖和异麦芽低聚糖，因此不能将母液中的小分子低聚糖有效转化为葡萄糖，因此开发一种能兼具两种催化功能的酶势在必行。

低聚糖脱支酶(Oligo-1,6-Glucosidase；EC 2.4.1.10)是属于糖苷水解酶家族13(GH13)的一类水解酶，能够特异性催化低聚糖分子α-1,6-糖苷键的断裂生成葡萄糖。然而，野生型低聚糖脱支酶难以催化母液中残留的麦芽低聚糖和异麦芽低聚糖，满足工业上提高葡萄糖产量的需求。因此，在野生型低聚糖脱支酶的基础上对其进行改造，扩大其催化底物范围，是扩大其应用范围及满足工业上提高葡萄糖产量的有效策略。

发明内容

为解决上述问题，本发明通过对来源于Paenibacillus sp.STB16的低聚糖脱支酶进行突变得到既能催化直链麦芽低聚糖又能催化异麦芽低聚糖的突变体V219A，其在原有催化异麦芽低聚糖的基础上，增加了直链麦芽低聚糖的催化能力，V219A催化母液(一次母液、二次母液、分离尾液)中残留的麦芽低聚糖和异麦芽低聚使产物中葡萄糖的百分含量分别高达99.21％、98.89％及97.97％，更能适应工业化生产。