[发明专利]用于Pin1异构活性检测的生物探针及其应用

权利要求书

1.基于荧光共振能量转移原理的生物探针，其特征在于，所述生物探针由供-受体对、连接体和Pin1识别域组成；所述供-受体对为两种颜色不同的荧光蛋白；所述Pin1识别域为含有Pin1的潜在识别位点Ser/Thr-Pro的肽段；所述连接体为富含疏水氨基酸残基短肽。

2.根据权利要求1所述的生物探针，其特征在于，供体为一种称为mClover3的绿色荧光蛋白，受体为一种称为mRuby3红色荧光蛋白。

3.根据权利要求1所述的生物探针，其特征在于，所述Pin1的序列如SEQ ID No.1所示。

4.根据权利要求1所述的生物探针，其特征在于，所述连接体包括连接体1和连接体2；所述连接体1与所述供体和所述Pin1识别域相连；所述连接体2与所述受体和所述Pin1识别域相连；所述连接体1和所述连接体2的氨基酸残基序列相同，如SEQ ID No.2所示。

5.根据权利要求1所述的生物探针，其特征在于，所述供体和所述受体的空间距离为1～10.08nm。

6.根据权利要求1所述的生物探针，其特征在于，根据Pin1与底物分子结合后导致Pin1产生的trans和cis两种不同的构象，分别设计不同的Pin1识别域；trans-识别域的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；cis-识别域的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

7.根据权利要求1所述的生物探针，其特征在于，利用所述生物探针检测离体细胞内Pin1异构活性的方法为：利用化学合成法合成所述生物探针融合蛋白的编码基因DNA片段；然后用DNA重组技术将所述DNA片段插入到真核基因表达质粒的多克隆位点上，重组质粒经测序比对和开放阅读框(ORF)分析确定无误后，将重组质粒导入癌细胞株中；转基因48小时后，用激光共聚焦显微镜观测所述癌细胞株的488nm及543nm波长激发光图像，并根据不同波长的荧光强度值进行FRET分析。

8.根据权利要求7所述的生物探针，其特征在于，所述编码基因DNA片段的氨基酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示；所述SEQ ID No.5含有trans-识别域的DNA片段，所述SEQ ID No.6含有cis-识别域的DNA片段。

9.一种用于潜在抗癌药物高通量筛选的模式细胞制备方法，其特征在于，所述方法为：将如SEQ ID No.5和/或SEQ ID No.6所示的DNA片段用化学方法合成后，插入到慢病毒载体质粒的多克隆位点上，并将重组慢病毒重组载体质粒包装成复制缺陷型慢病毒颗粒后转染各种癌细胞；慢病毒颗粒后转染后，通过与筛选标记基因相对应的筛选方法，将稳定表达所述生物探针整合蛋白的细胞株进行筛选纯化，得到用于潜在抗癌药物高通量筛选的模式细胞。

10.一种用于潜在AD治疗药物高通量筛选的模式细胞制备方法，其特征在于，所述方法为：将氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的DNA片段用化学方法合成后，插入到慢病毒载体质粒的多克隆位点上，并将重组慢病毒重组载体质粒包装成复制缺陷型慢病毒颗粒后转染各种AD病变模型细胞；在慢病毒颗粒后转染后，通过与筛选标记基因相对应的筛选方法，将稳定表达探针整合蛋白的细胞株筛选纯化，获得用于潜在AD治疗药物高通量筛选的模式细胞。