[发明专利]用于Pin1异构活性检测的生物探针及其应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于Pin1异构活性检测的生物探针及其应用。该生物探针由供‑受体对、连接体和Pin1识别域组成；其中，供体是一种称为mClover3的绿色荧光蛋白,受体是一种称为mRuby3红色荧光蛋白；识别域为含有Pin1的潜在识别位点Ser/Thr‑Pro的肽段；连接体为富含疏水氨基酸残基短肽。本专利根据荧光共振能量转移原理，首次拟用Ser/Thr‑Pro基序作为识别域构建能在不同活细胞内检测Pin1异构活性的FRET生物探针。本专利不仅为研究癌症及AD发生机制、早期诊断等提供了一个新方法，而且还可演变成抗癌药物、抗AD药物的高通量筛选设备。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于Pin1异构活性检测的生物探针及其应用。

背景技术

脯氨酰顺反异构酶1(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting1,Pin1)是一种能与蛋白质NIMA相互作用的肽脯氨酰顺反异构酶，也是目前所知道的唯一催化顺反异构的酶。Pin1由N端WW结构域，中间的柔性链接体及C端的PPIase结构域构成，每个结构域都有不同的配体结合位点，但只有PPIase结构域具有催化底物异构化的活性。人类代谢性疾病、心血管疾病、神经退行性疾病及癌症等疾病的发生与转归与细胞内肽酰脯氨酰顺反异构酶1活性异常相关，尤其是Pin1能够促进癌症发生、增殖、侵袭与转移，而成为治疗癌症的一个重要靶点。Pin1靶向药物筛选、癌症及阿尔茨海默病(AD)的诊断、转归与预后等活动都离不开细胞内Pin1活性的检测。

除少数报道外，目前针对细胞内Pin1的检测，大多采用PCR、定量PCR及各种免疫学原理的实验方法在转录水平及翻译水平上对细胞中Pin1表达含量和活性进行鉴定，如免疫组化、免疫印迹及免疫荧光等。然而这些方法不仅操作繁琐、需要耗费大量的人力物力，而且还需要将细胞破碎才能进行检测。尤其是，这些传统检测方法得到的结果只能说明Pin1蛋白或mRNA的丰度，又或者是Pin1与底物的相互作用，而不能说明Pin1的异构活性变化。以往针对Pin1催化底物异构检测的方法只见于神经细胞中的Tau(pThr231-Pro232)，在其它细胞中Pin1异构活性检测的方法很少见于报道。

荧光共振能量转移(FRET)技术在探测分子微小空间距离变化方面具有得天独厚的优势。在前期研究中我们发现Pin1靶位点(pSer/Thr-Pro)两端的距离会随着pSer/Thr-Pro的构象变化而改变，本专利根据荧光共振能量转移(FRET)原理，首次拟用Ser/Thr-Pro基序作为识别域构建能在不同活细胞内检测Pin1异构活性和构象变化方向的FRET生物探针，并用该探针在不同Pin1表达水平的细胞内，探讨Pin1的异构活性及构象变化响应的机制。本专利为后续开展癌症及AD发生机制、早期诊断及抗癌药物的高通量筛选设备等研究打下基础。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种基于荧光共振能量转移原理的生物探针，该探针可通过转基因技术转移到细胞内，并将细胞内Pin1的异构活性转换成不同波长的荧光信号，从而实现非损伤检测细胞内Pin1的异构活性。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

基于荧光共振能量转移原理的生物探针，所述生物探针由供-受体对、连接体和Pin1识别域组成；所述供-受体对为两种颜色不同的荧光蛋白；所述Pin1识别域为含有Pin1的潜在识别位点Ser/Thr-Pro的肽段；所述连接体为富含疏水氨基酸残基短肽。

本专利前期研究发现Pin1能特异性识别并导致外源性探针构象发生变化；同时研究表明癌症因子能特异性识别并导致外源性探针构象发生变化。

进一步，供体为一种称为mClover3的绿色荧光蛋白，受体为一种称为mRuby3红色荧光蛋白。

进一步，所述Pin1的序列如SEQ ID No.1所示。