[发明专利]一种筛选小鼠精子发生相关互作蛋白的方法及应用

权利要求书

1.一种小鼠单倍体生精细胞酵母双杂交cDNA文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法如下：

步骤S1：小鼠单倍体生精细胞的分选纯度与鉴定；

步骤S2：提取步骤S1中筛选出的小鼠单倍体生精细胞RNA，并反转录成单链cDNA，将单链cDNA通过PCR扩增形成双链cDNA并纯化；

步骤S3：应用醋酸锂法将双链cDNA与线性载体pGADT7-Rec共转化至感受态酵母细胞Y187中构建酵母双杂交cDNA文库；

步骤S4：酵母双杂交cDNA文库的鉴定。

2.根据权利要求1所述的小鼠单倍体生精细胞酵母双杂交cDNA文库的构建方法，其特征在于，所述步骤S1具体如下：取成年野生型小鼠睾丸经酶消化后获取睾丸单细胞悬液，使用活细胞DNA荧光染料Hochest33342处理细胞，于流式细胞仪分选小鼠单倍体生精细胞；Hochest33342+PNA双荧光鉴定小鼠单倍体生精细胞分选纯度。

3.根据权利要求1所述的小鼠单倍体生精细胞酵母双杂交cDNA文库的构建方法，其特征在于，所述步骤S2具体如下：采用酵母双杂交cDNA文库构建试剂盒的方法，以1μg小鼠单倍体生精细胞总RNA为模板，反转录成单链cDNA，再通过PCR扩增单链cDNA形成双链cDNA并对双链cDNA进行纯化，使用1.2％的琼脂糖对每个样品的PCR产物进行分析。

4.根据权利要求3所述的小鼠单倍体生精细胞酵母双杂交cDNA文库的构建方法，其特征在于，所述反转录过程中应用的引物为SMARIII及CDSIII，SMARIII如SEQ ID NO:1所示，CDSIII如SEQ ID NO:2所示；所述通过PCR扩增单链cDNA形成双链cDNA中应用的引物为5’PCR Primer及3’PCR Primer，5’PCR Primer如SEQ ID NO:3所示，3’PCR Primer如SEQ IDNO:4所示。

5.根据权利要求1所述的小鼠单倍体生精细胞酵母双杂交cDNA文库的构建方法，其特征在于，所述步骤S3具体如下：将双链cDNA、pGADT7-Rec、变性鲑鱼精DNA转化至感受态酵母细胞Y187后涂于SD/-Leu平板上，30℃培养3-5天直至克隆出现；洗脱下所有克隆，收集所有的液体，调整细胞密度约为2×10⁷-2×10⁸个/ml，按每管1ml分装，于-80℃冻存备用。

6.权利要求1所述的小鼠单倍体生精细胞酵母双杂交cDNA文库的构建方法构建的酵母双杂交cDNA文库在筛选小鼠精子发生相关互作蛋白中的应用。

7.权利要求6所述的应用的方法，其特征在于，所述方法如下：

步骤(1)：目的蛋白编码基因X酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-X的构建及鉴定；

步骤(2)：采用醋酸锂法分别将诱饵质粒pGBKT7-X及空载质粒pGBKT7转化至感受态酵母细胞AH109及Y187中；

步骤(3)：诱饵质粒pGBKT7-X对感受态酵母细胞AH109及Y187的毒性分析；

步骤(4)：诱饵质粒pGBKT7-X自激活活性分析；

步骤(5)：应用酵母交配法进行cDNA文库的筛选；

步骤(6)：阳性克隆的表型验证；

步骤(7)：直接酵母双杂交对阳性克隆进行酵母中相互作用进行验证；

步骤(8)：应用免疫共沉淀技术及双重免疫荧光染色技术对X与Y是否相互作用进行验证。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体如下：根据NCBI数据库小鼠X基因序列设计特异性PCR引物扩增编码蛋白的开放阅读框序列；1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并割胶回收PCR产物，采用pGEMT-easy试剂盒将PCR产物插入pGEM-T-easy载体内，经序列测定确认正确无误后，使用特定的限制性内切酶进行双酶切该质粒及pGBKT7载体，将两者连接后转化至大肠杆菌，经双酶切鉴定筛选阳性克隆。