[发明专利]一种筛选小鼠精子发生相关互作蛋白的方法及应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种筛选小鼠精子发生相关互作蛋白的方法及应用，通过提取小鼠单倍体生精细胞RNA反转录、扩增合成双链cDNA，并与pGADT7‑Rec共转化至Y187中构建酵母双杂交cDNA文库；扩增目的蛋白编码基因序列并构建诱饵质粒，与cDNA文库共培养后接种于营养缺失型培养基上，经多次铺板排除假阳性后挑取蓝色单克隆菌落进行PCR鉴定及测序，确认相互作用蛋白；构建的文库可应用于不同目的蛋白大批量、多次筛选小鼠精子发生相关蛋白；提供的筛选方法，可以同时大量获取目的蛋白的互作蛋白及其编码基因序列，为深入研究精子发生相关蛋白的功能及分子机制提供可能。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种筛选小鼠精子发生相关互作蛋白的方法、一种小鼠单倍体生精细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及应用。

背景技术

不孕不育症是一种多因素、复杂的病理生理过程，研究表明异常精液参数是近50％非自愿无子女的不育男性中主要的相关因素，主要表现为精子发生障碍及形成异常，其中精子发生障碍约占男性不育因素的85％。精子发生是雄性生殖系统中高度特异、严格管控的多阶段持续分化的生物学进程，精子发生异常将导致少弱畸精子症，形成雄性不育表型。精子发生涉及有丝分裂、减数分裂、遗传重组、染色质重塑、精子变形等复杂的生物学变化，这一高度有序的进程受到众多基因及其编码蛋白的严格调控，基因表达紊乱将导致精子发生障碍产生不育表型。精子发生过程包含多种睾丸特异性基因在不同时期的特异性表达，其产物蛋白的表达多与精子细胞RNA的表达丰度相应，超过80％的蛋白质是与其他蛋白质相互作用形成稳定或瞬时复合物结构而发挥作用。在精子发生中，各阶段特异性基因及其蛋白质产物的正确表达是精子形成的重要保障。

酵母双杂交(Yeast Two-hybrid System)是利用遗传学方法在酵母真核细胞体内研究蛋白质之间相互作用的高通量生物学技术，应用于蛋白与宿主细胞的互作机制、蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域。

目前，小鼠、大鼠、兔、羊和人类睾丸组织cDNA文库已成功构建，由于睾丸包括生精细胞、间质细胞及支持细胞等多种成分，因此利用睾丸cDNA文库筛选与精子发生相关蛋白其特异性及阳性率均不理想，同时，以往研究蛋白质互作的生化技术，如偶联、免疫共沉淀、以及串联亲和层析等体外实验易受环境、实验条件等诸多因素影响的问题。因此迫切需要进一步构建单倍体生精细胞cDNA文库进行精子发生的相关研究。目前小鼠单倍体生精细胞酵母双杂交cDNA文库构建未见商品化销售及文献报道，因而该文库的成功构建，将成为探究小鼠精子发生相关机制的基本工具。

发明内容

本发明针对上述现有技术存在的问题，提供一种筛选小鼠精子发生相关互作蛋白的方法，一种小鼠单倍体生精细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明目的之一在于，提供一种小鼠单倍体生精细胞酵母双杂交cDNA文库的构建方法。本方法适用于构建某种单细胞酵母双杂交cDNA文库，可以显著提升对标研究相关领域互作蛋白筛选的阳性率及灵敏度，具有操作简便、成本低廉、适用范围广等特点。

一种小鼠单倍体生精细胞酵母双杂交cDNA文库的构建方法，所述构建方法如下：

步骤S1：小鼠单倍体生精细胞的分选纯度与鉴定；

步骤S2：提取步骤S1中筛选出的小鼠单倍体生精细胞RNA，并反转录成单链cDNA，将单链cDNA通过PCR扩增形成双链cDNA并纯化；

步骤S3：应用醋酸锂法将双链cDNA与线性载体pGADT7-Rec共转化至感受态酵母细胞Y187中构建酵母双杂交cDNA文库；

步骤S4：酵母双杂交cDNA文库的鉴定。