[发明专利]一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体、CAR-NK细胞及用途

权利要求书

1.一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体，其特征在于，其包含针对人巨细胞病毒的单链抗体和NKG2D胞外结构域、跨膜区、胞内信号转导区以及IL-15/IL-15Rα细胞因子。

2.根据权利要求1所述的靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体，其特征在于，还包含位于所述胞外抗原结合域和所述跨膜区之间的铰链域。

3.一种核苷酸，其特征在于，其编码如权利要求1或2所述的嵌合抗原受体。

4.一种表达载体，其特征在于，其包括权利要求3所述的核苷酸。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述载体是病毒载体。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述病毒载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。

7.一种靶向人巨细胞病毒的CAR-NK细胞，其特征在于，其用权利要求4-6任一项所述的载体转导。

8.一种靶向人巨细胞病毒的CAR-NK细胞的构建方法，其特征在于，其包括以下步骤：

（1）构建靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体，其包含针对人巨细胞病毒的单链抗体和NKG2D胞外结构域、跨膜区、胞内信号转导区以及IL-15/IL-15Rα细胞因子；

（2）嵌合抗原受体转导NK细胞，步骤如下：

①构建包含嵌合抗原受体的逆转录病毒载体：

将步骤（1）的嵌合抗原受体通过NcoI和MluI酶切位点克隆到SFG.CNb30_opt.IRES.eGFP载体内；挑选单克隆进行酶切鉴定、测序鉴定，鉴定正确的质粒再转化感受态DH5α，扩增后提取质粒；质粒转染293A细胞，进行CAR蛋白表达鉴定；

②逆转录病毒包装；

③NK细胞分选和激活；

用磁珠法分选得到NK细胞，与100Gy辐照后的CD48/4-1BBL/mbIL-21 K562细胞按照固定比例共培养激活，激活后第四天进行病毒感染；

④病毒感染：

感染前以PBS配制相应体积的RetroNectin溶液包被Non-treated Tissue Culture 24孔板，500mL/孔，封口膜封口4℃包被过夜或37℃包被2小时，RetroNectin溶液回收后在-20℃冻存，可冻融2次；

包被后弃去RetroNectin，加入病毒液，Parafilm封闭孔板，离心2000g×9分钟，RT，收取激活后的NK细胞，以一定密度中烟，接种后再离心Parafilm封闭孔板，离心2000g×9分钟，RT。

9.一种组合物，其包括如权利要求7的CAR-NK细胞或由权利要求8构建方法构建的CAR-NK细胞，和药学上可接受的载体。

10.如权利要求7所述的细胞在制备治疗靶向人巨细胞病毒感染的药物中的用途。