[发明专利]一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体、CAR-NK细胞及用途

说明书

本发明公开了一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体、CAR‑NK细胞及用途。一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体，其包含针对人巨细胞病毒的单链抗体和NKG2D胞外结构域、跨膜区、胞内信号转导区以及IL‑15/IL‑15Rα细胞因子。本发明涉及的CAR结构一方面可以结合HCMV感染细胞，杀伤病毒感染细胞，同时也能发挥诱饵作用，竞争性结合病毒颗粒，抑制其感染作用。本发明方法进行CAR基因转导，CAR在NK细胞中表达阳性率最高可达90%以上，分群明显，随着时间推移CAR表达比例稳定。

技术领域

本发明涉及生物技术工程领域，具体涉及了一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体、CAR-NK细胞及用途。

背景技术

人巨细胞病毒（HCMV）感染是造血干细胞移植（HSCT）或实体器官移植（SOT）术后的常见并发症，被称为移植的巨魔。移植术后HCMV感染可直接引发肺炎、肝炎、胃肠疾病、脑炎和CMV综合征等，还会间接增加急慢性排斥反应和其他机会感染的发生率，严重影响预后。移植后HCMV感染的治疗一直是医学界关注的热点，目前大部分移植中心使用更昔洛韦、膦甲酸钠等抗病毒药物防治移植后HCMV感染，存在着骨髓抑制、肾毒性和易产生耐药等问题。以HCMV抗原多肽和CD3单抗和IL-2等细胞因子体外诱导、扩增、制备细胞毒性T淋巴细胞（CMV-CTL），联合抗病毒药物治疗移植后HCMV感染效果良好，然而，存在异体CTL细胞需要HLA配型，自体T细胞活性弱及细胞来源不足等问题，难以规模化应用于临床。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体、CAR-NK细胞及用途。

本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：

第一方面，一种靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体，其包含针对人巨细胞病毒的单链抗体和NKG2D胞外结构域、跨膜区、胞内信号转导区以及IL-15/IL-15Rα细胞因子。

在本发明中，靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体还包含位于所述胞外抗原结合域和所述跨膜区之间的铰链域。

第二方面，一种核苷酸，其编码如上述的嵌合抗原受体。

第三方面，一种表达载体，其包括如上述的核苷酸。

在本发明中，所述载体是病毒载体。

在本发明中，所述病毒载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。

第四方面，一种靶向人巨细胞病毒的CAR-NK细胞，其用如上述的载体转导。

第五方面，一种靶向人巨细胞病毒的CAR-NK细胞的构建方法，其包括以下步骤：

（1）构建靶向人巨细胞病毒的嵌合抗原受体，其包含针对人巨细胞病毒的单链抗体和NKG2D胞外结构域、跨膜区、胞内信号转导区以及IL-15/IL-15Rα细胞因子；

（2）嵌合抗原受体转导NK细胞，步骤如下：

①构建包含嵌合抗原受体的逆转录病毒载体：

将步骤（1）的嵌合抗原受体通过NcoI和MluI酶切位点克隆到SFG.CNb30_opt.IRES.eGFP载体内；挑选单克隆进行酶切鉴定、测序鉴定，鉴定正确的质粒再转化感受态DH5α，扩增后提取质粒；质粒转染293A细胞，进行CAR蛋白表达鉴定；

②逆转录病毒包装；

③NK细胞分选和激活；

用磁珠法分选得到NK细胞，与100Gy辐照后的CD48/4-1BBL/mbIL-21 K562细胞按照固定比例共培养激活，激活后第四天进行病毒感染；

④病毒感染：

感染前以PBS配制相应体积的RetroNectin溶液包被Non-treated TissueCulture 24孔板，500mL/孔，封口膜封口4℃包被过夜或37℃包被2小时，RetroNectin溶液回收后在-20℃冻存，可冻融2次；