[发明专利]一种适用于弧菌的真空冷冻干燥保护剂与冻干方法

说明书

本发明提供了一种适用于弧菌的真空冷冻干燥保护剂与冻干方法，属于微生物菌种资源保藏技术领域。本发明提供的适用于弧菌的真空冷冻干燥保护剂，以水为溶解剂，包括如下浓度的成分：胎牛血清50～150mL/L、脱脂乳40～120g/L、海藻糖30～90g/L、甘露醇40～100g/L、聚乙烯吡咯烷酮10～50g/L、氯化钠5～40g/L。本发明提供的弧菌冻干保护剂与冻干方法适用范围广、步骤简单易操作、成本低、实用性强、保存效率高，可用于对多种来源弧菌菌株的同步保存，避免了因保存不当和超低温条件限制而导致的菌种资源丢失。

技术领域

本发明涉及微生物菌种资源保藏技术领域，尤其涉及一种适用于弧菌的真空冷冻干燥保护剂与冻干方法。

背景技术

弧菌(Vibrio sp.)是一种具有显著生物多样性的喜盐细菌，为革兰氏阴性，营化能异养和兼性厌氧性，细胞呈现短杆状、弯曲状、S形或螺旋形等多形态。大部分弧菌靠鞭毛运动，多为单端极生鞭毛。现已报道的弧菌属种类有137种，根据遗传相似度可以将其划分为14个弧菌簇群(Vibrio clades)，100多个种。在世界各地的海洋、河口及淡水系统中自然存在，且为多数脊椎动物和无脊椎动物的病原体和共生体，可导致多种海洋动物患病。在现已报道的海水养殖动物中，近50％的致病原为弧菌，主要包括霍乱弧菌(V.cholerae)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、费氏弧菌(V.fischeri)、创伤弧菌(V.vulnificus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、鳗弧菌(V.anguillarum)和副溶血弧菌(V.parahemolyticus)等，这些病原菌被认为是海水养殖产业的“灾祸之源”，可导致多种水产养殖动植物大规模死亡。其中由副溶血性弧菌、鳗弧菌、溶藻弧菌和哈维伊弧菌引起的弧菌病可引起50多种经济鱼类疾病，给水产养殖业的健康发展造成严重威胁。另外，在海洋系统中，弧菌作为其他生物体中的共生菌、益生菌和致病菌，参与多种大分子有机物的降解过程，是生物地球化学循环的重要媒介。因此，它们的菌株经常被用作细菌发光、群体感应、多染色体基因组的生物模型。

菌种保藏和管理是微生物工作者普遍关注的问题，它要求菌种在保藏和管理过程中不灭亡、不被污染，并保持较高的存活率及遗传稳定性，以便长期开发使用。而由于微生物种质资源长期保藏困难，遗传变异几率较大，直接影响菌株的遗传稳定性和科学研究的持续性。弧菌的生理代谢功能和毒力作用除由遗传基因决定以外，环境胁迫作用也对其起到决定性作用，多种毒力和生理代谢表型的体现是由基因修饰决定的。目前国际上正大力推广的是液氮超低温保藏法，此方法在超低温条件下(-150℃-196℃)能使微生物的代谢降到最低水平，因而菌种基本上不发生变异。但由于弧菌具有强烈的内源性呼吸作用，在低温下容易死亡。并且由于其为革兰氏阴性细菌，并没有形成芽孢的能力，且阴性菌的细胞膜结构使得其对于温度的敏感度较强，低温保存和超低温保藏都将在一定程度上对细菌造成伤害，并且长期的低温保存容易使得细菌进入活的不可培养状态，加大菌株保藏难度。因此，长期有效的保藏弧菌资源是为进一步对其病原病理学及致病机制研究的基础保障。

真空冷冻干燥技术是现阶段公认的一种保存效果好、保藏成本低、技术应用范围广的微生物种质长期保藏方法。但面对具有不同遗传代谢属性的多种弧菌菌株，不同类别的弧菌所需要的最佳保护剂与冻干条件也不尽相同。因此，优化形成可适用于不同弧菌的通用保护剂配方及冻干方法，成为生产实践与科研活动中提供适合多种菌株通用的有效冻干保护剂与保藏方法的核心技术之一。但目前大部分研究仍停留在单一菌株的真空冷冻干燥保藏技术，涉及多种弧菌的冻干保存方法鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于弧菌的真空冷冻干燥保护剂与冻干方法，用于海水弧菌菌株的真空冷冻干燥保藏，可实现对不同类别弧菌的同步真空冷冻干燥保藏。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：