[发明专利]一种细胞外囊泡装载金纳米颗粒的方法及其产品和应用

权利要求书

1.一种细胞外囊泡装载金纳米颗粒的方法，其特征在于，金纳米颗粒经过聚乙二醇与细胞穿膜肽CPP修饰后，与细胞外囊泡共孵育将其转载至细胞外囊泡中，使用尺寸排阻色谱柱去除游离的金纳米颗粒，包括以下步骤：

（1）金纳米颗粒的制备：取0.01% HAuCl₄ 水溶液100 mL，加热至沸腾，在磁力搅拌下加入1 %的柠檬酸钠Na₃Cit 水溶液，继续煮沸15 min，冷却后以去离子水恢复到原体积，离心3次用去离子水重悬，得到金纳米AuNPs溶液备用；

（2）金纳米颗粒的修饰：称取烷基封端的聚乙二醇SH-PEG₅₀₀₀-Alkyl(C_nH_2n)和SH-PEG₅₀₀₀-OCH₃，按照摩尔比为1：99的配比，20 PEG molecule/nm² 的浓度加入至AuNPs溶液中，在超声振荡下反应1 h，获得PEG-AuNPs 离心3次，使用去离子水重悬；称取细胞穿膜肽CPP，与PEG-AuNPs按一定比例混合，4℃ 共孵育过夜，获得CPP-PEG-AuNPs，离心3次去除未结合的CPP；

（3）细胞外囊泡的提取：500 mL细胞上清或生物液体，在4℃依次经过500 g (10 min)、2000 g (20 min)、15000 g (30 min)离心，去沉淀；离心后的液体过0.22 μm的滤膜；120000 g 离心90 min 弃上清，保留沉淀，用PBS吹打重悬沉淀；120000 g离心90 min 纯化EV，弃上清，使用500 μL的PBS重悬，获得细胞外囊泡；

（4）AuNPs的装载：500 μL 的细胞外囊泡与500 μL的CPP-PEG-AuNPs混合4℃摇床共孵育过夜，使用尺寸色谱排阻柱去除游离的AuNPs。

2.根据权利要求1所述的一种细胞外囊泡装载金纳米颗粒的方法，其特征在于，步骤（2）中所述的烷基封端的聚乙二醇SH-PEG5000-Alkyl烷基链长度（n）为6-18；所述的多肽（CPP）包括但不限于细胞穿膜肽Cys-TAT 、Cys-R8的N端残基为半胱氨酸细胞穿膜肽。

3.根据权利要求1所述的一种细胞外囊泡装载金纳米颗粒的方法，其特征在于，步骤（3）中，细胞系选择包括SKOV-3人卵巢癌细胞系、HCT116人结肠癌细胞系、A549人肺癌细胞系；所述的生物液体包括尿液、血浆。