[发明专利]一种细胞外囊泡装载金纳米颗粒的方法及其产品和应用

说明书

本发明涉及一种细胞外囊泡装载金纳米颗粒的方法及其产品和应用，金纳米颗粒经过聚乙二醇与细胞穿膜肽修饰后，与细胞外囊泡共孵育将其转载至细胞外囊泡中，使用尺寸排阻色谱柱去除游离的金纳米颗粒。获得最终产物可用于生物CT成像等方面。本发明可应用于不同来源的细胞外囊泡的提取与金纳米颗粒的装载，制备方法简单，利用细胞外囊泡的生物相容性好、靶向特定组织特点，提高CT对比剂的组织特异性，为临床靶向递送系统的制备提供新思路。

技术领域

本发明涉及一种生物医用材料技术领域的方法，具体是一种细胞外囊泡外源性装载金纳米颗粒的方法及其产品和应用。金纳米颗粒经过聚乙二醇与细胞穿膜肽修饰后，与细胞外囊泡共孵育将其转载至细胞外囊泡中，使用尺寸排阻色谱柱去除游离的金纳米颗粒。获得最终产物可用于生物CT成像等方面。

背景技术

金纳米颗粒具有独特的光电、物化性质及良好的生物相容性。在肿瘤的显像方面的检测能力比现在常用的造影剂高出几个数量级。

细胞外囊泡是细胞分泌并释放到外基质的膜性小囊泡，广泛存在于生物体液中，参与细胞间信号传递、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等多种过程。近年来在药物递送领域的潜力受到了国内外学者的广泛研究和关注，与人工脂质体相比，细胞外囊泡具有更大的载药能力、更好的生物相容性且具备靶向特定组织的功能。目前，细胞外囊泡的药物装载方法主要分为两种，即内源性装载或外源性装载。内源性装载指在母源细胞上进行操作完成药物装载，如细胞转染法、药物与细胞共孵育法。这些方法的局限性在于载药量有限，且仅适用于细胞培养来源的细胞外囊泡的装载，而生物体液来源、植物组织来源的细胞外囊泡则无法使用该种装载方法。外源性装载指在提取细胞外囊泡之后进行药物装载，包括电穿孔法、反复冻融法、挤压法、超声振荡法等。外源性装载的局限性有装载率低，破坏膜结构等。

发明内容

本发明目的在于提供一种细胞外囊泡装载金纳米颗粒的方法。

本发明的再一目的在于：提供一种上述方法制备的细胞外囊泡装载金纳米颗粒产品。

本发明的又一目的在于：提供一种上述产品的应用。

本发明目的通过下述方案实现：通过柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒，使用巯基聚乙二醇和细胞穿膜肽修饰。超速离心法获得细胞外囊泡，将金纳米颗粒与细胞外囊泡共孵育后，使用尺寸色谱排阻柱去除游离的金纳米颗粒，获得细胞外囊泡装载的金纳米颗粒。

发明包括以下步骤：一种细胞外囊泡装载金纳米颗粒的方法，其特征在于，金纳米颗粒经过聚乙二醇与细胞穿膜肽修饰后，与细胞外囊泡共孵育将其转载至细胞外囊泡中，使用尺寸排阻色谱柱去除游离的金纳米颗粒，包括以下步骤：

（1）金纳米颗粒的制备：取0.01% HAuCl₄ 水溶液100 mL，加热至沸腾，在磁力搅拌下加入1 %的Na₃Cit 水溶液，继续煮沸15 min，冷却后以去离子水恢复到原体积，离心3次用去离子水重悬备用；

（2）金纳米颗粒的修饰：称取SH-PEG₅₀₀₀-Alkyl(C_nH_2n)和SH-PEG₅₀₀₀-OCH₃，按照摩尔比为1：99的配比，20 PEG molecule/nm² 的浓度加入至AuNPs溶液中，在超声振荡下反应1h，获得PEG-AuNPs 离心3次，使用去离子水重悬。称取CPP多肽，与PEG-AuNPs按一定比例混合，4℃ 共孵育过夜，获得CPP-PEG-AuNPs，离心3次去除未结合的CPP；

（3）细胞外囊泡的提取：500 mL细胞上清或生物液体依次经过500 g (10 min) 、2000 g (20 min)、15000 g (30 min) 4℃离心，去沉淀。离心后的液体过0.22 μm的滤膜。120000 g 离心90 min 弃上清，保留沉淀，用PBS吹打重悬沉淀。120000 g离心90 min 纯化EV，弃上清，使用500 μL的PBS重悬，获得细胞外囊泡；