[发明专利]一种水稻粳-籼亚种的检测引物组、试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了一种水稻粳‑籼亚种的检测引物组、试剂盒和检测方法，包括如下步骤：1)设计合成引物；所述引物由上游内引物FIP、下游内部引物BIP、上游外部引物F3和下游外部引物B3组成，所述引物的碱基序列如SEQ ID No：1‑4；2)取水稻样品，使用改良CTAB法提取基因组DNA；3)利用4条引物，配制LAMP反应体系并设定反应条件，对提取的样品基因组DNA在63‑65度进行环介导等温扩增。4)根据反应溶液颜色的变化判断样品是粳稻还是籼稻。通过本发明提供的方法可以快速准确的诊断出水稻的粳‑籼亚种，在现场检测中具有推广价值，有利于快速区分水稻亚种类型。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及水稻粳-籼亚种的检测方法，具体来说是一种水稻粳-籼亚种的检测引物组、试剂盒和检测方法。

背景技术

亚洲水稻可分为籼稻、粳稻这两个亚种，在国际上也称为Oryza sativaL.subs.indica亚种与Oryza sativa L.subs.japonica亚种。

目前对籼稻、粳稻进行鉴别的主要方法是通过形态学鉴别，这种鉴别方法存在中间过渡类型而不能清晰进行鉴别的缺点，并且由于长期的自然或人为杂交，水稻的遗传信息交流频繁，细胞核的DNA成分复杂，因此，基于核DNA的差异标记进行籼-粳亚种的鉴别难度较大。

有研究人员发现在籼稻叶绿体DNA的Pst I-12片段ORF100区域有69bp碱基缺失，与粳稻存在较大的差异。目前已有基于此缺失片段建立的普通PCR技术及荧光PCR技术，但是普通PCR技术还需结合琼脂糖凝胶电泳才能辨别结果，荧光PCR所需试剂及设备成本较高，不适合大规模推广，相较于前两种方法，环介导等温扩增技术(LAMP)显示出了其独特的优越性。

环介导等温扩增技术(LAMP)是一种快速的DNA检测技术，不需要PCR仪，而是在等温条件下(通常为60-65℃)使用一组识别目标核苷酸序列中六个不同区域的四种引物扩增特定DNA。因此，LAMP产生了特异性的长扩增产物，可以被观察到。由于扩增产物由多重复靶序列的茎环状和花椰菜状组成，通过琼脂糖凝胶电泳检测会呈现特有的梯形条带。但这种方法耗时较长，且需要打开反应管进行电泳操作，很容易造成假阳性污染。在扩增反应过程中形成大量核酸扩增产物时，产生肉眼可见的白色焦磷酸镁沉淀，直接通过浊度仪来判断扩增结果，但反应难以通过肉眼观察。

因此有必要研究一种简单、且可以通过肉眼直接观察的检测方法，从而快速鉴别水稻属于籼稻还是粳稻。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种水稻粳-籼亚种的检测引物组，所述引物组包括一对外引物、一对内引物；

上游外引物F3：5’CTATTTTTGTTCTTATACCCATGC3’(SEQ ID NO:1)；

下游外引物B3：5’ATCTATGGGGTCACAGCC3’(SEQ ID NO:2)；

上游内引物FIP：5’CCAAGAAAGGCTATTTTTTAAGGGAAATAGAGAGCGA GTGGGAA3’(SEQID NO:3)；

下游内引物BIP：5’ATGGAATAATCCTGAATTCCAATGTGGTCGTGGTAAATC CATGAA3’(SEQID NO:4)。

其中，所述上游内引物FIP包含F1c和F2：

F1c：5’CCAAGAAAGGCTATTTTTTAAGGGA3’；

F2：5’AATAGAGAGCGAGTGGGAA3’。

其中所述下游内引物BIP包含B1c和B2：

B1c：5’ATGGAATAATCCTGAATTCCAATG3’；