[发明专利]一种水稻粳-籼亚种的检测引物组、试剂盒和检测方法在审
申请号: | 202211530717.8 | 申请日: | 2022-12-01 |
公开(公告)号: | CN115852036A | 公开(公告)日: | 2023-03-28 |
发明(设计)人: | 方勇;李心月;李彭;裴斐;沈飞;邢常瑞 | 申请(专利权)人: | 南京财经大学 |
主分类号: | C12Q1/6895 | 分类号: | C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12N15/11 |
代理公司: | 上海骁象知识产权代理有限公司 31315 | 代理人: | 赵俊寅 |
地址: | 210046*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 水稻 籼亚种 检测 引物 试剂盒 方法 | ||
本发明公开了一种水稻粳‑籼亚种的检测引物组、试剂盒和检测方法,包括如下步骤:1)设计合成引物;所述引物由上游内引物FIP、下游内部引物BIP、上游外部引物F3和下游外部引物B3组成,所述引物的碱基序列如SEQ ID No:1‑4;2)取水稻样品,使用改良CTAB法提取基因组DNA;3)利用4条引物,配制LAMP反应体系并设定反应条件,对提取的样品基因组DNA在63‑65度进行环介导等温扩增。4)根据反应溶液颜色的变化判断样品是粳稻还是籼稻。通过本发明提供的方法可以快速准确的诊断出水稻的粳‑籼亚种,在现场检测中具有推广价值,有利于快速区分水稻亚种类型。
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域,涉及水稻粳-籼亚种的检测方法,具体来说是一种水稻粳-籼亚种的检测引物组、试剂盒和检测方法。
背景技术
亚洲水稻可分为籼稻、粳稻这两个亚种,在国际上也称为Oryza sativaL.subs.indica亚种与Oryza sativa L.subs.japonica亚种。
目前对籼稻、粳稻进行鉴别的主要方法是通过形态学鉴别,这种鉴别方法存在中间过渡类型而不能清晰进行鉴别的缺点,并且由于长期的自然或人为杂交,水稻的遗传信息交流频繁,细胞核的DNA成分复杂,因此,基于核DNA的差异标记进行籼-粳亚种的鉴别难度较大。
有研究人员发现在籼稻叶绿体DNA的Pst I-12片段ORF100区域有69bp碱基缺失,与粳稻存在较大的差异。目前已有基于此缺失片段建立的普通PCR技术及荧光PCR技术,但是普通PCR技术还需结合琼脂糖凝胶电泳才能辨别结果,荧光PCR所需试剂及设备成本较高,不适合大规模推广,相较于前两种方法,环介导等温扩增技术(LAMP)显示出了其独特的优越性。
环介导等温扩增技术(LAMP)是一种快速的DNA检测技术,不需要PCR仪,而是在等温条件下(通常为60-65℃)使用一组识别目标核苷酸序列中六个不同区域的四种引物扩增特定DNA。因此,LAMP产生了特异性的长扩增产物,可以被观察到。由于扩增产物由多重复靶序列的茎环状和花椰菜状组成,通过琼脂糖凝胶电泳检测会呈现特有的梯形条带。但这种方法耗时较长,且需要打开反应管进行电泳操作,很容易造成假阳性污染。在扩增反应过程中形成大量核酸扩增产物时,产生肉眼可见的白色焦磷酸镁沉淀,直接通过浊度仪来判断扩增结果,但反应难以通过肉眼观察。
因此有必要研究一种简单、且可以通过肉眼直接观察的检测方法,从而快速鉴别水稻属于籼稻还是粳稻。
发明内容
针对现有技术中存在的问题,本发明提供了一种水稻粳-籼亚种的检测引物组,所述引物组包括一对外引物、一对内引物;
上游外引物F3:5’CTATTTTTGTTCTTATACCCATGC3’(SEQ ID NO:1);
下游外引物B3:5’ATCTATGGGGTCACAGCC3’(SEQ ID NO:2);
上游内引物FIP:5’CCAAGAAAGGCTATTTTTTAAGGGAAATAGAGAGCGA GTGGGAA3’(SEQID NO:3);
下游内引物BIP:5’ATGGAATAATCCTGAATTCCAATGTGGTCGTGGTAAATC CATGAA3’(SEQID NO:4)。
其中,所述上游内引物FIP包含F1c和F2:
F1c:5’CCAAGAAAGGCTATTTTTTAAGGGA3’;
F2:5’AATAGAGAGCGAGTGGGAA3’。
其中所述下游内引物BIP包含B1c和B2:
B1c:5’ATGGAATAATCCTGAATTCCAATG3’;
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