[发明专利]NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体、编码序列、基因工程菌及应用

说明书

本发明提供了一种NADH依赖型7β‑羟基类固醇脱氢酶突变体、编码序列、基因工程菌及应用。对来源于鸡粪木质乳杆菌的NADH依赖型7β‑羟基类固醇脱氢酶进行突变，获得的突变体Cle7β‑3的还原活力提高了4.3倍，还原氧化活力比值提高了9倍，且有良好的底物耐受性，在浓度为100mM的7‑oxo‑LCA条件下孵育2小时，活力仅下降了10.5％；突变体Cle7β‑3在30℃，pH8.0条件下催化合成熊去氧胆酸，牛磺熊去氧胆酸，熊胆酸和12‑酮‑熊去氧胆酸，都能在3小时内将相应的底物转化完全。突变后的7β‑HSDH极大程度地降低了生产成本，提高了生产效率，更适合于工业化应用。

技术领域

本发明属于基因工程及酶工程领域，具体涉及一种NADH依赖型7β-羟基类固醇脱氢酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及它们在制备熊去氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸、熊胆酸和12-酮-熊去氧胆酸中的应用。

背景技术

熊去氧胆酸(UDCA)是名贵中药——“熊胆粉”的主要有效成分，目前已应用于治疗各种肝胆疾病，帕金森症甚至用于新冠的辅助治疗，具有明显的疗效。UDCA传统的制备方法是采用“活熊引流法”从熊的胆囊中插入导管提取，但这种方法手段过于残忍有违动物保护法且产物收率低，导致UDCA价格昂贵，无法大规模工业应用。

当前，工业上生产UDCA和T-UDCA主要有化学和酶法合成，其中化学合成法是通过七步反应且需要使用大量有毒试剂合成的，这导致其成本高，“三废”严重和条件苛刻等；而酶法具有成本较低、工艺简单、绿色无污染及反应条件温和等优点，因此日益受到重视。

在酶法合成UDCA过程中，都要使用一种重要的酶——7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-hydroxysteroid dehydrogenase，7β-HSDH，EC 1.1.1.201)，其主要作用是催化7-酮取代胆酸上7位的酮基还原成β-型羟基，从而得到这种重要的医用原料药及其相应类似物。

野生型7β-HSDH来源十分广泛，目前，国内外科研工作者已经筛选出众多产7β-HSDH的微生物并将其编码基因克隆出来，如产气柯林斯菌(Collinsellaaerofaciens)、撒丁岛梭菌(Clostridium absonum)、活泼瘤胃菌属(Ruminococcusgnavus)、扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques ATCC 35915)、马赛梭菌(Clostridium Marseille)等。与此同时，许多科研工作者运用蛋白质工程手段对野生型7β-HSDH进行突变改造以提高其工业应用能力。如中国专利CN109182284A中，黄斌等对产气柯林斯菌(Collinsellaaerofaciens)来源的野生型7β-HSDH进行突变，突变体E175D/E197D活力提高8倍且解除了产物抑制，应用该突变体制备UDCA和T-UDCA,100mM的底物都能在2小时内转化完全。如中国专利CN 106636285A中，傅荣昭等对来源于Turneriella parva的野生型7β-HSDH进行突变，突变体V38R/V39R的活力由254.8U/ml提高到412.8U/ml，其反应温度由25℃提高到30℃，酶液投量和NADP+投量显著降低。如中国专利CN 105274070A中，刘志斌等对来源于活泼瘤胃菌属来源的7β-HSDH进行突变，其突变子RU-8C2和RU-4F9的活力由野生型的5.1U/ml提高到9.5U/ml和16.6U/ml，其对应的氨基酸残基变化分别为T210N和L3M/T219N。Mingmin Zheng等(J.Agric.Food Chem.,2017,65(6),pp 1178-1185)对来源于Ruminococcus torques ATCC35915的7β-HSDH进行突变，他们采用易错PCR和DNA重排的定向进化手段，其突变子V3-1的比活由野生型的21.9U/mg提高到41.8U/mg，对应的氨基酸残基为T189V/V207M。尽管如此，这些报道的7β-HSDH都是NADPH依赖型的，而辅酶NADP(H)价格昂贵且不稳定，这大大限制了该酶在工业生产UDCA上的应用。相对于NADP(H)来说，NAD(H)价格只有NADP(H)的七分之一且更加稳定，进行辅酶循环次数更多，更不易钝化。因此，采用NADH依赖型的7β-羟基类固醇脱氢酶替代当前工业应用的NADPH依赖型的7β-羟基类固醇脱氢酶，其更具有成本优势及应用前景。