[发明专利]一种mRNA 3`末端测序文库快速构建方法及应用

权利要求书

1.一种mRNA 3′末端测序文库的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：采用逆转录引物对片段化的RNA进行逆转录，获得cDNA第一链产物；cDNA第一链使用连接酶连接环化，环化产物再用核酸内切酶酶切进行线性化，线性化产物进行PCR扩增，得到mRNA3′末端测序文库；

所述的逆转录引物从5′端至3′端依次包括：与测序引物配对的序列、一个脱碱基位点dSpacer、与测序引物配对的序列、UMI、oligo dT、VN，5′末端带有PO₄修饰。

2.根据权利要求1所述的mRNA 3′末端测序文库的构建方法，其特征在于：所述的连接酶为ssDNA/RNA环化连接酶，所述的核酸内切酶为APE1酶。

3.根据权利要求1所述的mRNA 3′末端测序文库构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)提取样品总RNA；

2)将1)所得RNA变性，NaOH强碱水解获得长度100-500nt的片段化RNA产物，去除基因组DNA；

3)采用逆转录引物对2)所得产物进行逆转录，获得cDNA第一链产物；

4)去除逆转录引物及RNA，采用磁珠分选纯化100-500nt范围的cDNA片段；

5)cDNA第一链使用连接酶连接环化，环化产物再用核酸内切酶酶切进行线性化获得建库模板；

6)线性化产物进行PCR扩增，采用磁珠分选纯化250-500bp PCR产物，即获得mRNA 3′末端测序文库。

4.根据权利要求4所述的mRNA 3′末端测序文库的构建方法，其特征在于：步骤2)中，RNA的水解条件为：NaOH终浓度为0.02M～0.03M，27℃～37℃条件下，反应25～40min。

5.根据权利要求1或4所述的mRNA 3′末端测序文库的构建方法，其特征在于：所述的逆转录引物的序列为：

其中在引物5′末端带有PO₄修饰，()内标记一个dSpacer，作为核酸内切酶APE1识别位点，其中标_的序列illumina sequence read1下游互补序列，其中标的序列illumina sequence read2上游互补序列。

6.根据权利要求4所述的mRNA 3′末端测序文库的构建方法，其特征在于：步骤4)中，去除逆转录引物的方法为：在上一步逆转录体系中加入3μL Exonuclease，37℃反应1小时；去除各种RNA的方法为：采用NaOH水解，在终浓度为0.04M的NaOH中，98℃孵育20分钟。

7.根据权利要求3所述的mRNA 3′末端测序文库的构建方法，其特征在于：

步骤4)中，所述的磁珠为诺唯赞RNA clean beads，磁珠分选纯化体积比例是产物体积的0.9～1.8倍；

步骤6)中，所述的磁珠为诺唯赞DNAclean beads，磁珠分选纯化体积比例是产物体积的0.75～1.5倍。

8.根据权利要求4所述的mRNA 3′末端测序文库的构建方法，其特征在于：步骤5)中，环化cDNA产物进行线性化试剂和条件为：0.5μL线性化缓冲液和1μl APE1，37℃孵育1小时；线性化缓冲液成分包括240mM乙酸镁和25mM二硫苏糖醇。

9.权利要求1-8任一项所述的方法在mRNA3′末端测序研究中的应用。

10.一种用于mRNA3′末端测序文库构建的试剂盒，其特征在于：基于权利要求1-8任一项所述的方法。