[发明专利]一种mRNA 3`末端测序文库快速构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种mRNA 3'末端测序文库快速构建方法及应用。本发明方法包括如下步骤：采用逆转录引物对片段化的RNA进行逆转录，获得cDNA第一链产物；cDNA第一链使用连接酶连接环化，环化产物再用核酸内切酶酶切进行线性化，线性化产物进行PCR扩增，得到mRNA 3′末端测序文库。所述逆转录引物从5′端至3′端包括与测序引物配对的序列、一个脱碱基位点dSpacer、与测序引物配对的序列、UMI、oligo dT、脱氧核苷酸VN，5′末端带有POsubgt;4/subgt;修饰。本发明效率高，操作简单，样品损耗少，能以低浓度样品得高质量clean reads，在基础研究、临床诊断、药物研发等领域有广泛应用。

技术领域

本发明涉及高通量测序文库及文库构建领域，更具体地，涉及一种mRNA′3′末端测序文库快速构建方法及应用。

背景技术

分子生物学的中心法则解释了遗传信息从DNA到功能性蛋白的流动，大多数情况下，mRNA在丰度、中间体和功能产物之间存在线性关系。对于mRNA来说，信使RNA前体(Pre-mRNAs)剪接加工为成熟mRNA是转录过程中的重要步骤，对mRNA功能及稳定性有关键作用。

大多数人类基因的mRNA加工过程是以某种条件或某种细胞类型的相关方式表达不同的转录异构体。替代启动子和转录本终止位点分别决定了5′和3′非翻译区(UTR)的边界，UTR包含大量影响mRNA稳定性、局部化和翻译率的序列和结构原件，即使是有相同编码区但不同UTR异构体可能产生不同的功能结果，也可能会将该蛋白质定位到不同的亚细胞区室，这些都是造成亚型及功能区别的主要原因。

目前对人类多聚腺苷酸化(APA)组织图谱分析表明，一般基因都有多个Poly A位点，在Pre–mRNA加工过程中，交替切割和多聚腺苷酸化会产生编码序列或不同的3′UTR异构体，APA可保护Pre-mRNA核糖核酸免受酶降解，并促进核输出和翻译。因此3′末端加工的缺陷会影响对Poly-A位点选择，对3′UTR更深入的理解对治疗发展具有重要意义。

最近的几项研究报告了APA调节广泛存在于免疫系统、神经发育和肿瘤发生以及诱导多能干细胞的产生。有趣的是，细胞的整体APA谱与其增殖和分化状态也密切相关。例如，近端poly(A)位点倾向于用于增殖或未分化细胞，导致产生具有较短3′UTR的mRNA，而远端poly(A)位点倾向于用于分化细胞，导致mRNA具有较长的3′UTR。越来越多的实验说明APA比以前预期要普遍得多，并且APA调节在各种生理和病理过程中起着重要作用。

APA产生不同3′UTR的mRNA，可通过多种机制影响基因表达。如3′UTR富含AU、GU的元件和microRNA靶位点以及RNA结合蛋白(RBP)位点。大多数癌症表达的转录本比相应的正常组织的3′UTR短，针对miRNA的抑制作用，癌基因的短3′UTR同种型比长3′UTR更稳定，事实表明通过APA缩短3′UTR可导致癌细胞中致癌基因的激活，因此miRNA在3′UTR的靶向位点会改变疾病基因的转化，有利于发现治疗癌症、心血管病等疾病治疗靶标。除此，RBP可以识别特定的基元、简并位点或二级结构，3′UTR的APA会引起RBP结合基序的数量改变，可以介导mRNA的稳定性、定位和效率，从而对基因转录有增强或衰减的调控作用。

另一方面，3′UTR影响基因表达的相关性与Poly(A)位点的选择有关，有许多例子说明mRNA 3′末端的加工在人类血液学、免疫和神经疾病以及癌症中经常发生失调。如单个poly(A)位点的损失、获得或突变已在血液病中观察到，如多内分泌病肠病X-连锁综合征(IPEX)主要是由于维持T细胞调节的转录调节因子FOXP3的突变，其PAS(Poly A site，AATAAA到AATGAA)中的A-G突变使FOXP3转录本的非特异性降解，导致FOXP3表达减少，从而不能正常维持T细胞调节。还有一些转录本3′末端因单核苷酸多态性(SNP)导致受损，增加癌症的易感性。由此，了解APA如何在时间和空间上受到调节至关重要。