[发明专利]一种产甾药前体的基因工程菌及其用途

说明书

本发明公开了一种产甾药前体的基因工程菌和用途。基因的缺失在调控分枝杆菌产甾药前体的产量或改造产甾药前体的分枝杆菌中的用途，所述基因包括编码羟酰辅酶A脱氢酶的基因和/或3‑甾酮‑9α‑羟化酶A亚基的基因。本发明3‑甾酮‑9α‑羟化酶A和羟酰辅酶A脱氢酶在分枝杆菌转化甾醇过程中具有重要的调控作用。同时本发明还构建了一种产甾药前体的基因工程菌，将基因工程菌接种到以甾醇为底物的培养基中发酵，能得到纯度高、产量高的甾药前体21‑羟基‑20‑甲基孕甾‑1,4‑二烯‑3‑酮，其能作为原料合成泼尼松龙、醋酸泼尼松龙等甾体药物，因此在工业上具有潜在而广泛的应用价值。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种产甾药前体的基因工程菌及其用途。

背景技术

甾体药物应用广泛，包括治消炎、抗过敏等多种医疗应用。甾体药物目前市场规模较大，已成为仅次于抗生素的第二大类药物，并且具有较好的市场前景。主流甾体药物的合成路线有两条，一条是以薯蓣皂素为原料，通过化学合成生成中间体双烯醇酮醋酸酯，再经过后续反应，可以得到黄体酮、氢化可的松等药物；该路线以化学合成为主，但其反应线路长、收率低，对环境会造成污染，并且生产成本较高。另一条路线是植物甾醇为原料，利用微生物的代谢，将其转化成不同的甾药前体，例如雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)、1,4-雄甾二烯-3,17-二酮(ADD)和9α羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)等甾药前体，再经过化学合成制备成目标甾体药物。该路线的原料来源稳定、反应路线短、收率高、生产成本低且更加环保，因此目前逐渐成为生产甾药前体的主流工艺。但是甾体药物行业利用微生物转化的甾药前体大多是C19类甾体，C22类甾体的开发也仅限21-羟基-20-甲基孕甾-4-烯-3-酮(4-HP)而缺乏其他甾药前体，限制了甾体药物行业的发展。

分枝杆菌等微生物具有代谢甾醇等天然固醇的能力，因此通过控制微生物降解甾醇类物质过程中的各种酶的活性，可以获得多种重要的甾药前体。但是，由于甾醇降解是多酶参与的多步反应过程，加之对侧链代谢分子机制的不甚了解，目前也仅有可生产AD、ADD、9α-OH-AD、4-HP和睾酮等少数几个甾药前体的工程菌株被构建，远不能满足行业的需求。

21-羟基-20-甲基孕甾-1,4-二烯-3-酮，英文名为21-hydroxy-20-methyl-pregna-1,4-dien-3-one(简称1,4-HP)，是一种新型的C22类甾药前体。由于1,4-HP的C1-C2位为双键，并且C17侧链保留了类似皮质类激素的侧链结构，因此，和传统C19类甾药前体(ADD和9α-OH-AD等)相比，1,4-HP更适合作为甾药前体用于合成泼尼松龙等皮质类激素甾体药物。因此，1,4-HP生产菌种的开发对促进传统甾药生产体系的革新具有重要意义。但是，目前生产1,4-HP的菌株的产量、纯度及转化率未能尽如人意，生产过程中存在较多副产物，给后续的分离纯化造成了困难。

因此，如何获得高效、专一的可转化甾醇生产甾药前体，特别是1,4-HP的优良菌种成为甾体医药行业的迫切需求。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种产甾药前体的基因工程菌和用途，以期解决现有技术中存在的问题。

为实现上述目的，本发明具体采用如下技术方案。

本发明的第一方面保护，基因在调控分枝杆菌产甾药前体的产量或改造产甾药前体的分枝杆菌中的用途，所述基因为编码羟酰辅酶A脱氢酶的基因和/或3-甾酮-9α-羟化酶A亚基的基因。通过研究意外发现敲除编码羟酰辅酶A脱氢酶的基因和/或3-甾酮-9α-羟化酶A亚基的基因能提高分枝杆菌产甾药前体的产量，特别是21-羟基-20-甲基孕甾-1，4-二烯-3-酮(1,4-HP)的产量。

根据本发明的技术方案，所述编码3-甾酮-9α-羟化酶A亚基的基因为如下A1)-A4)中的至少一项；

A1)所述基因为kshA1；所述kshA1的核苷酸序列包括如SEQ ID NO.1所述序列；