[发明专利]一种多孔硅脱氧核酶荧光探针及在中药抗癌活性评价中的应用

权利要求书

1.一种检测microRNA的多孔硅脱氧核酶荧光探针，包括氨基修饰的多孔二氧化硅纳米粒子、装载于所述多孔二氧化硅纳米粒子的孔道结构中的荧光分子和共价连接在所述多孔二氧化硅纳米粒子表面将所述荧光分子封堵于所述孔道结构内的两种DNA发卡HP1、HP2；其中，所述HP1的核苷酸序列中包含待测microRNA的互补序列，所述HP2的核苷酸序列中含有锌离子特异性脱氧核酶的酶切位点；HP1与待测microRNA结合后，根部被打开，HP1环部发生构型变化并与HP2的环部核苷酸序列结合，在锌离子的辅助下激活锌离子特异性脱氧核酶，继而在酶切位点处将HP2切断，对应的被封堵孔道被打开，装载于该孔道结构中的荧光分子得以释放，通过荧光分子强度实现对待测microRNA的检测。

2.根据权利要求1所述的多孔硅脱氧核酶荧光探针，其特征在于，所述氨基修饰的多孔二氧化硅纳米粒子通过如下步骤制备：

(1)化学合成：取适量十六烷基三甲基溴化铵溶于氢氧化钠溶液中，然后依次加入适量四乙氧基硅烷和3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌反应，静置，待溶液分层后，离心，得到白色沉淀，再用乙醇、纯水洗涤，烘干；

(2)去除模板：将沉淀溶解在盐酸-乙醇溶液中，回流提取，离心，将得到的白色沉淀用乙醇、纯水洗涤，烘干，得到氨基修饰的多孔二氧化硅纳米粒子粉末。

3.根据权利要求2所述的多孔硅脱氧核酶荧光探针，其特征在于，所述荧光分子为ce6，在所述多孔二氧化硅纳米粒子的孔道结构中装载荧光分子的步骤如下：

取适量氨基修饰的多孔二氧化硅纳米粒子粉末均匀分散于pH＝7.0的N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液中，加入适量用于连接DNA与多孔二氧化硅纳米粒子上氨基的N-ε-马来酰亚胺基己酰-氧琥珀酰亚胺酯对多孔二氧化硅纳米粒子改性，离心，将沉淀均匀分散于pH＝7.0的N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液中，加入适量ce6，混合，离心，将沉淀分散于pH＝7.0的N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液中。

4.根据权利要求3所述的多孔硅脱氧核酶荧光探针，其特征在于，在所述多孔二氧化硅纳米粒子表面共价连接DNA发卡HP1、HP2的方法为：将装载有荧光分子的多孔二氧化硅纳米粒子与新鲜制备的DNA发卡HP1、HP2混合，常温反应适量时间，离心，纯水洗涤，将沉淀复溶于pH＝7.0的N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液中。

5.根据权利要求4所述的多孔硅脱氧核酶荧光探针，其特征在于，所述microRNA为microRNA21，DNA发卡HP1、HP2通过如下方法制备：取适量DNA 1、DNA2分别与适量三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐常温混合，还原DNA中的二硫键；然后，将还原后的DNA退火处理，常温静置，分别得到DNA发卡HP1、DNA发卡HP2；

其中：

DNA 1的序列为：5’-TTTT GATG TTGATTC TCC GAG CCG GTC GAAATAGTG GGT TTT TTTTTT TTT TTT TTT TT T CAACAT CAG TCT GATAAG CTA-HS-3’；

DNA 2的序列为：5’-CGA CGA CG TTT TTT ACC CAC TAT rA G GAA T CAA C TTT TTTCG TCG TCG TTTT-HS-3’。

6.一种制备权利要求5所述多孔硅脱氧核酶荧光探针的方法，其特征在于，包括步骤：将装载荧光分子ce6的氨基修饰的多孔二氧化硅纳米粒子与新鲜制备的DNA发卡HP1、DNA发卡HP2混合，常温温和反应，离心，收集沉淀，纯水洗涤，将沉淀复溶于pH＝7.0的N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸缓冲液中。

7.权利要求1～4任一所述多孔硅脱氧核酶荧光探针在检测microRNA中的应用。

8.权利要求5所述多孔硅脱氧核酶荧光探针在检测microRNA21中的应用。