[发明专利]一种多孔硅脱氧核酶荧光探针及在中药抗癌活性评价中的应用

说明书

本发明公开了一种多孔硅脱氧核酶荧光探针及在中药抗癌活性评价中的应用，该荧光探针包括氨基修饰的多孔二氧化硅纳米粒子、装载于纳米粒子孔道中的荧光分子和共价连接在纳米粒子表面的DNA发卡HP1、HP2；其中，HP1序列中包含待测microRNA的互补序列，HP2序列中含有锌离子特异性脱氧核酶的酶切位点；HP1与microRNA结合后，根部被打开，HP1环部发生构型变化并与HP2环部核苷酸序列结合，在锌离子辅助下激活锌离子特异性脱氧核酶，继而在酶切位点处将HP2切断，纳米粒子孔道中荧光分子释放，通过荧光分子强度实现对microRNA的检测。该探针能够特异、灵敏的检测体系中痕量的microRNA。

技术领域

本发明属于材料领域，涉及荧光探针及应用，具体涉及一种多孔硅脱氧核酶荧光探针及在中药抗癌活性评价中的应用。

背景技术

中药在治疗癌症方面具有多靶点、副作用小等优势，能够通过增强患者自身的免疫系统，减少治疗过程中的不良反应，提高患者的生活质量。在各种乳腺癌症类型中，三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)是雌激素受体、孕激素受体和人类表皮生长因子受体2表达均为阴性的一类乳腺癌，具有高转移性、高复发性等特点，临床治愈率低，预后差。

在TNBC发生和发展的过程中，机体会对异常的肿瘤细胞做出反应而使体内某些物质发生含量变化，包括基因产物、蛋白质、激素、多胺和酶类等。其中，microRNA作为TNBC临床诊断中可信赖的指标之一，能够反映TNBC的发展进程。中药中的许多单体成分如小檗碱、丹参酮ⅡA、槲皮素、姜黄素等，能够调节TNBC细胞内microRNA的含量，抑制癌细胞增殖、转移，降低TNBC的高转移性、高复发性，在改善患者临床症状等方面均有显著疗效。

目前对癌症标志物microRNA检测的方法有多种，其中荧光分析具有设备简单、分析灵敏度高、选择性强、检测直观等优点，应用最为广泛。由于microRNA在体内含量极低，通常需结合适当的纳米材料，以提高检测的灵敏度。microRNA21作为一种具有调控基因表达作用的小分子，在机体正常生长发育、细胞增殖、凋亡等生理活动中发挥着重要的作用。microRNA21的含量变化可能预示着体内信号通路、蛋白质合成等的异常，可以作为疾病标志物用于预测癌症、代谢性疾病、病毒感染等进程，在疾病的早期预防和治疗中具有重要的意义。由于microRNA21含量少、序列短，需要一种灵敏度和准确性更高的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种多孔硅脱氧核酶荧光探针及在中药抗癌活性评价中的应用。

本发明上述目的通过如下技术方案实现：

一种检测microRNA的多孔硅脱氧核酶荧光探针，包括氨基修饰的多孔二氧化硅纳米粒子、装载于所述多孔二氧化硅纳米粒子的孔道结构中的荧光分子和共价连接在所述多孔二氧化硅纳米粒子表面将所述荧光分子封堵于所述孔道结构内的两种DNA发卡HP1、HP2；其中，所述HP1的核苷酸序列中包含待测microRNA的互补序列，所述HP2的核苷酸序列中含有锌离子特异性脱氧核酶的酶切位点；HP1与待测microRNA结合后，根部被打开，HP1环部发生构型变化并与HP2的环部核苷酸序列结合，在锌离子的辅助下激活锌离子特异性脱氧核酶，继而在酶切位点处将HP2切断，对应的被封堵孔道被打开，装载于该孔道结构中的荧光分子得以释放，通过荧光分子强度实现对待测microRNA的检测。

优选地，所述氨基修饰的多孔二氧化硅纳米粒子通过如下步骤制备：

(1)化学合成：取适量十六烷基三甲基溴化铵溶于氢氧化钠溶液中，然后依次加入适量四乙氧基硅烷和3-氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌反应，静置，待溶液分层后，离心，得到白色沉淀，再用乙醇、纯水洗涤，烘干；

(2)去除模板：将沉淀溶解在盐酸-乙醇溶液中，回流提取，离心，将得到的白色沉淀用乙醇、纯水洗涤，烘干，得到氨基修饰的多孔二氧化硅纳米粒子粉末。