[发明专利]Cas蛋白截短体、构建其的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种Cas蛋白截短体、构建其的方法及其应用。所述Cas13蛋白截短体由以下(1)‑(3)中任一种组成：(1)相对如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列存在选自第623‑772位、第773‑922位、第923‑1072位、第623‑1072位、第923‑972位、第973‑1022位、第1023‑1072位、第973‑1072位、第623‑672位、第673‑722位、第723‑772位、第773‑822位、第823‑872位、第873‑922位、第1127‑1272位、第994‑1107位、第726‑827位、第263‑315位、第82‑132位、第187‑243位、第610‑661位、第593‑658位和第810‑905位的任一种缺失的截短体序列；(2)同源或异源蛋白结构域，以及(1)中所述截短体序列；(3)同源或异源蛋白结构域，(1)中所述截短体序列，以及用于连接所述蛋白结构域与所述截短体序列的连接序列。本发明的Cas蛋白截短体在保持编辑活性的同时大大减小了蛋白尺寸，便于AAV递送，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种Cas蛋白截短体、构建其的方法及其应用。

背景技术

CRISPR-Cas13是一种基于细菌免疫系统的RNA靶向和编辑系统，可保护细菌免受病毒侵害。CRISPR-Cas13系统类似于CRISPR-Cas9系统，但与靶向DNA的Cas9蛋白不同，Cas13蛋白通常靶向RNA。

CRISPR-Cas13属于Type VI CRISPR系统，它包含一个单一的Cas13效应蛋白。目前，CRISPR-Cas13根据系统发育可分为多个亚型(如Cas13a、Cas13b、Cas13c和Cas13d)。然而，目前对于发现尺寸紧凑(例如，适用于AAV递送)和/或在哺乳动物细胞中编辑效率高(例如，RNA靶向/切割活性)的新Cas13系统仍存在迫切的需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有技术中缺少小尺寸、高编辑效率的Cas蛋白，为此本发明提供了Cas蛋白截短体、构建其的方法及其应用。本发明的Cas蛋白截短体在具备编辑活性的同时大大减小了蛋白尺寸，便于AAV(腺相关病毒)递送，具有广泛的应用前景。

本发明具体通过以下技术方案解决上述技术问题。

本发明的第一方面提供一种构建Cas蛋白截短体的方法，所述方法包括将参比Cas蛋白的三维结构与晶体结构已知且为相同型(或亚型)的活性Cas蛋白的三维结构叠合，识别所述参比Cas蛋白与所述活性Cas蛋白的三维结构不一致的一个或更多个连续氨基酸序列，并人工缺失所述连续氨基酸序列中的一个或更多个氨基酸，得到所述Cas蛋白截短体；

所述三维结构不一致是指所述参比Cas蛋白与所述活性Cas蛋白在所述连续氨基酸序列上的α螺旋数量相差≥1个和/或β折叠数量相差≥1个。

本发明一些实施方案中，所述Cas蛋白截短体可与指导多核苷酸形成CRISPR复合物。进一步地，在一些实施方案中，所述指导多核苷酸可指导所述CRISPR复合物与靶核酸的序列特异性结合。

本发明一些实施方案中，所述连续氨基酸序列的长度为1-300aa。

本发明一些较佳实施方案中，所述连续氨基酸序列的长度为5-300aa、10-300aa、20-300aa、30-300aa、40-300aa、50-300aa、40-250aa、40-200aa、40-190aa、40-180aa、40-170aa、40-160aa、40-150aa、50-250aa、50-200aa、50-190aa、50-180aa、50-170aa、50-160aa或50-150aa。

本发明一些实施方案中，所述参比Cas蛋白为Cas9、Cas12或Cas13型。

本发明中，所述参比Cas蛋白的三维结构优选通过实验测定得到或程序预测得到。