[发明专利]一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条

权利要求书

1.一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条，其特征在于，所述试纸条包括依次设置在PVC底板上的样品垫、标记物垫、NC膜和吸水滤纸，所述样品垫设置有加样孔用于滴加待检测动物血清样本，所述标记物垫中有荧光微球标记的小鼠IgG和GRA1重组抗原，所述NC膜上包被有T线和C线，所述T线包被的是GRA1重组抗原，所述C线包被的是山羊抗小鼠IgG。

2.根据权利要求1所述的一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

步骤一，GRA1重组抗原的制备：合成含有相对目的基因的表达载体pET-28a，构建好的重组表达质粒命名为pET-28a-GRA1，将构建的原核表达载体pET-28a-GRA1转入BL21(DE3)表达感受态中进行蛋白小量诱导表达确定培养条件后，收集菌体，使用高压破碎后离心弃上清，沉淀用ddH₂O重悬，加入一定量HisBindingBuffer室温感作一定时间，离心收集上清后与Ni-Agrose在一定温度下感作一定时间，用咪唑洗脱杂蛋白，再用含有脲素的咪唑洗脱目的蛋白，测蛋白浓度；

步骤二，标记物垫的制备：用标记缓冲液将荧光微球按一定比例稀释后，得到荧光标记溶液，用此荧光标记溶液分别标记小鼠IgG和GRA1重组抗原；用荧光工作液将荧光微球标记的小鼠IgG和荧光微球标记的GRA1重组抗原分别进行稀释，并混合制备成荧光溶液；将制得的荧光溶液喷涂在玻璃纤维上制备成为标记物垫，放入烘箱中烘干后密封保存；

步骤三，T线和C线的制备：GRA1重组抗原用于包被T线，山羊抗小鼠IgG用于包被C线，用喷金划膜仪将T线和C线包被于NC膜上，放入烘箱中烘干后密封保存；

步骤四，试纸条的组装：将样品垫、标记物垫、NC膜和吸水纸从左到右顺次安装在PVC底板上组装成试纸条。

3.根据权利要求2所述的一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，荧光微球标记的小鼠IgG的制备方法为：

取一定量荧光微球加入一定量标记缓冲液中，加入一定终浓度的EDC，振荡混匀后，室温孵育一定时间，然后加入一定标记量的小鼠IgG，振荡混均，室温避光孵育一定时间；加入一定终浓度的BSA，振荡混匀后，室温避光孵育一定时间；离心去除上清，得到浓缩的荧光微球标记的鼠IgG，加入荧光微球工作液，避光保存。

4.根据权利要求2所述的一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，荧光微球标记的GRA1重组抗原的制备方法为：

取一定量荧光微球加入一定量的标记缓冲液中，加入一定终浓度的EDC振荡混匀后，室温孵育一定时间，然后加入一定标记量的GRA1重组抗原，振荡混均，室温避光孵育一定时间；加入一定终浓度的BSA，振荡混匀后，室温避光孵育一定时间；离心去除上清，得到浓缩的荧光微球标记的GRA1重组抗原，加入荧光微球工作液，避光保存。

5.根据权利要求2所述的一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，用荧光工作液将荧光微球标记的小鼠IgG进行稀释的最佳稀释比例为20倍稀释，用荧光工作液将荧光微球标记的GRA1重组抗原进行稀释的最佳稀释比例为3倍稀释。

6.根据权利要求2所述的一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，用荧光标记溶液分别标记小鼠IgG和GRA1重组抗原，小鼠IgG的标记量为20μg/mL，即1mL的荧光微球溶液加入小鼠IgG的量为20μg；GRA1重组抗原的标记量为25μg/mL，即1mL的荧光微球溶液加入GRA1重组抗原的量为25μg。

7.根据权利要求2所述的一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，GRA1重组抗原用于包被T线，最佳GRA1重组抗原包被浓度为1mg/mL，山羊抗小鼠IgG用于包被C线，山羊抗小鼠IgG包被浓度为2mg/mL。