[发明专利]一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条

说明书

本发明公开了一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条，包括样品垫、标记物垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水纸和PVC底板。所述标记物垫中有荧光微球标记的小鼠IgG和GRA1抗原；所述NC膜的测试线(T线)包被的是GRA1抗原，控制线(C线)包被的是山羊抗小鼠IgG。将样品垫、标记物垫、NC膜和吸水纸从左到右顺次安装在PVC底板上组装成试纸条。本发明提出的试纸条可用于多种动物(猪、猫等)弓形虫病血清抗体的快速检测，具有检测快速、灵敏度高、特异性好的优点，可应用于基层畜牧业。

技术领域

本发明涉及弓形虫检测技术领域，具体涉及一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条。

背景技术

刚地弓形虫是一种专性细胞内寄生的原虫，能够感染包括人类在内的所有温血动物。弓形虫在全世界分布广泛，据估计全世界大约有超过1/3的人口感染。家畜猪、牛、羊及宠物猫是弓形虫的重要宿主，目前感染率最高的动物是猪和猫。人们因食用未煮熟或生的含有弓形虫的肉或肉制品获得感染，也可通过接触猫粪便中弓形虫卵囊获得感染，对免疫力低下的人群和孕妇危害最为严重，另外弓形虫病也给畜牧业带来严重经济损失。

目前，还没有针对弓形虫病的特效治疗药物，仅磺胺嘧啶和乙胺嘧啶联合应用治疗弓形虫急性感染，但仅是抑制其生长而无法杀灭虫体。寻找一种可靠的抗原，建立一种简便、快速、准确度高、特异性好的诊断方法，可以帮助基层养殖业快速准确诊断动物的弓形虫病，减少畜牧业损失和对人们的危害。

发明内容

为此，本发明提供一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条，以实现一种可以用于现场检测的、准确性高的且简便的快速检测动物弓形虫病的试纸条。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

根据本发明实施例的第一方面，提出一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条，所述试纸条包括依次设置在PVC底板上的样品垫、标记物垫、NC膜和吸水滤纸，所述样品垫设置有加样孔用于滴加待检测动物血清样本，所述标记物垫中有荧光微球标记的小鼠IgG和GRA1重组抗原，所述NC膜上包被有T线和C线，所述T线包被的是GRA1重组抗原，所述C线包被的是山羊抗小鼠IgG。

根据本发明实施例的第二方面，提出一种快速检测动物弓形虫病的荧光免疫层析法试纸条的制备方法，所述制备方法包括：

步骤一，GRA1重组抗原的制备：由上海生工生物工程有限公司合成了含有相对目的基因的表达载体p ET-28a，构建好的重组表达质粒。命名为pET-28a-GRA1。通过小量诱导表达确定大量表达及纯化条件：在32℃，0.1mM IPTG浓度下诱导表达。在32℃，0.1mM IPTG诱导条件下培养菌液6h～8h后，收集菌体，使用高压破碎后，离心弃上清，沉淀用100μLddH2O重悬，加入15mL His Binding Buffer室温感作12h，离心收集上清后与Ni-Agrose在4℃感作2h，用5mM咪唑洗脱杂蛋白，再用500mM含有脲素的咪唑洗脱目的蛋白，测蛋白浓度；

步骤二，标记物垫的制备：用标记缓冲液将荧光微球按1:20比例稀释后，得到荧光标记溶液，用此荧光标记溶液分别标记小鼠IgG和GRA1重组抗原；用荧光工作液将荧光微球标记的小鼠IgG和荧光微球标记的GRA1重组抗原分别进行稀释，并混合制备成荧光溶液；将此荧光溶液喷涂在玻璃纤维上制备成为标记物垫，放入温度45±1℃湿度≤35％烘箱中，烘干8小时以上，铝箔袋密封保存；

步骤三，T线和C线的制备：GRA1重组抗原用于包被T线，山羊抗小鼠IgG用于包被C线，用喷金划膜仪将T线和C线包被于NC膜上，放入温度45±1℃湿度≤35％烘箱中，烘干8h以上，铝箔袋密封保存；

步骤四，试纸条的组装：将样品垫、标记物垫、NC膜和吸水纸从左到右顺次安装在PVC底板上组装成试纸条。

进一步地，所述步骤二中，荧光微球标记的小鼠IgG的制备方法为：