[发明专利]恒温扩增检测猴痘病毒的组合物、试剂盒及其用途

说明书

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及恒温扩增检测猴痘病毒的组合物、试剂盒及用途。使用本发明的组合物，对猴痘病毒与西非分型或猴痘病毒与刚果金分型进行快速诊断和区分，在反应体系中实现猴痘病毒的检测和分型，并且其可在42℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，扩增产物可通过Ct值判读阳性或阴性。本发明建立的检测方法灵敏度可达到500copies/mL，特异性高，对扩增仪器的要求低，且可在30min内完成检测，操作简单，减少污染和误差，无需对样品进行复杂处理、适合现场检测，适于体外诊断推广应用。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及恒温扩增检测猴痘病毒的组合物、试剂盒及用途。

背景技术

猴痘病毒为双链DNA病毒，与天花病毒同属痘病毒科，是一种人畜共患病，具有致病性、传染性、流行性和传播广。2022年5月以来，一些非流行国家报道了猴痘病例，并存在社区传播。猴痘病毒可通过直接接触患者或者被感染的动物，或通过患者的体液传播，毒力强的病毒株有可能致死，一旦猴痘病毒传入将造成极大的危害，临床表现为潜伏期5-21天，多为6-13天，发病早期出现寒战、发热，体温多在38.5℃以上，可伴头痛、嗜睡、乏力、背部疼痛和肌痛等症状；多数患者出现颈部、腋窝、腹股沟等部位淋巴结肿大(猴痘疗诊指南2022年版)。

目前传统的PCR检测方法如荧光定量PCR技术(Real-time qPCR)是目前应用较多的检测手段，但始终存在着非特异性扩增和引物二聚体影响实验的特异性和灵敏度，因此引物设计的难度和非特异性扩增的问题意味着技术局限性，且其对温度的要求比较高，对实验室设备要求高，成本高，实验耗时较长一般运行时间为1小时30-40分钟，因此建立快速检测猴痘病毒的生物学方法具有重要的现实意义。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，是一种快速、特异、灵敏的核酸检测手段，基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，在37℃-42℃恒温条件下对特定核酸序列进行荧光扩增，最终扩增产物以指数级增长，完成靶标基因的扩增。该技术操作简便，20-30分钟即可反应完全，灵敏度可达500copies/mL，且不需要特定的仪器进行，适用于体外诊断、现场检测和生物安全等领域。

因此，本领域需求一种恒温扩增的产品，其能够用于检测猴痘病毒，并且操作简便，20-30分钟即可反应完全，灵敏度高。

发明内容

有鉴于此，第一方面，本发明提供一种恒温扩增检测猴痘病毒的组合物，包括：

猴痘病毒通用引物对：

正向引物F：5’-ATACCTTTACATCTCACAATAATCATTTAC-3’

反向引物R：5’-CATTCACAGATTCTATTGTGAGTCGTGTTA-3’

探针P：

5’-AGGCTTGTCTAAGTTGTAACGGAAGATGTGATAGTA[THF]TCAGGT AGAGACGCG-3’；

西非分支引物对：

正向引物F：5’-AATAGATATCAGAATACTTCAAAGATATGT-3’

反向引物R：5’-TGAATGCGGCATGATAGTATCATTCTTTGT-3’

探针P：

5’-GAATTTCGAGATTAAATGTAACAACAAAGATTCATC[THF]TCCAAA CAGTTAACG-3’；

刚果金分支引物对的核酸序列为：

正向引物F：5’-GTGGGTGGATTGGACCATTCTCCTCCTGAA-3’