[发明专利]一种通过双/多顺反子表达系统调控铁蛋白在细胞内自组装的方法

说明书

本发明提供了一种通过双/多顺反子表达系统调控铁蛋白在细胞内自组装的方法，通过双顺反子表达系统或多顺反子表达系统，将含不同组分的铁蛋白亚基单体在原核生物内自组装，得到可控组装的融合表达铁蛋白。本发明利用多/顺反子表达系统，在一个细胞中同时表达融合铁蛋白亚基和野生型铁蛋白亚基，减少外源加入的大尺寸蛋白的影响，克服了铁蛋白融合表达的阈值效应，使正常情况下难以融合表达的蛋白，可以与铁蛋白亚基一起成功组装成融合表达的铁蛋白笼状颗粒，而且可以精确控制不同组分的铁蛋白亚基单体在铁蛋白笼状结构中的比例。通过将抗体的单链可变区片段与铁蛋白融合表达，赋予铁蛋白以高亲和力特异性结合某种蛋白或靶向某种细胞的能力。

技术领域

本发明创造属于生物技术领域，尤其是涉及一种通过双/多顺反子表达系统调控铁蛋白在细胞内自组装的方法。

背景技术

铁蛋白(Ferritin，FTn)是一种由24个亚基组成的笼状蛋白。生理条件下，铁蛋白24个单亚基可自发组装成完整的笼状结构，其外径为12nm，内径为8nm，在大部分生物中都高度保守，主要负责体内铁的运输和储存。由于其内部的空腔，铁蛋白可以负载药物，成像分子。最近发现人重链铁蛋白可通过与转铁蛋白受体1(Transferrin Receptor 1,TfR1)结合从而靶向到肿瘤细胞。除此之外，由于结构上的高度稳定性和高耐热性，铁蛋白可以十分经济的被纯化。因此，铁蛋白是一种理想的纳米载体。

融合表达(fusion expression)，指将外源多肽/蛋白基因与另一蛋白基因的相连构建成融合基因进行表达，可使外源多肽/蛋白表达为融合蛋白的一部分。铁蛋白稳定的结构，多亚基在体内自发组装成笼状结构的特性使其成为优秀的表面展示和融合表达支架蛋白。由于铁蛋白笼状结构表面游离的N端及伸进笼状结构内部游离的C端，各种肽，结构域甚至小蛋白可融合表达在铁蛋白表面或装载在铁蛋白内部，改善其体内体外各个方面的物理化学性质，提高了其作为纳米载体的通用性，普适性。

但是随着外源多肽/蛋白复杂度的增高以及尺寸的增大，相邻亚基间的位阻效应限制了融合铁蛋白亚基的自组装，无法可溶性表达。这使融合铁蛋白的表达及纯化受到极大的限制，往往需要复杂的手段才能将融合蛋白纯化出来，包括包含体的变性和复性，亲和层析等。由于复杂的纯化过程，即使将融合蛋白纯化出来也不能保证其具有原本的生理活性。

多顺反子表达系统也称多启动子表达系统，是将多个目的基因克隆于同一表达载体并在大肠杆菌中共同表达的技术，包括双顺反子表达系统和三顺反子表达系统。除此之外，还可以将多个外源基因分别构建到不同的载体中去，并通过多个载体在大肠杆菌中的共同表达，实现多个外源基因的共表达。在研究多个相关基因或蛋白的共同作用和生物蛋白的体外合成中起着十分重要的作用。

发明创造内容

鉴于此，本发明旨在提出一种通过双/多顺反子表达系统调控铁蛋白在细胞内自组装的方法，这种方法能够允许不同分子量多肽/蛋白与铁蛋白可溶性融合表达，可有效提高大分子蛋白与铁蛋白融合表达效率，降低融合表达铁蛋白表达纯化的难度，进一步丰富了铁蛋白作为纳米载体的活性及功能。

为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：

一种通过双/多顺反子表达系统调控铁蛋白在细胞内自组装的方法，其特征在于：通过双顺反子表达系统或多顺反子表达系统，将含不同组分的铁蛋白亚基单体在原核生物内自组装，得到可控组装的融合表达铁蛋白。进一步的，通过控制表达不同组分铁蛋白亚基单体的基因的顺反子个数，调控不同组分的铁蛋白亚基单体在铁蛋白笼状结构中的比例。

进一步的，所述原核生物为大肠杆菌。

进一步的，所述双顺反子表达系统通过双顺反子质粒构建，所述双顺反子质粒为pCDFDuet-1、pRSFDuet-1、pACYCDuet-1、pColADuet-1、pETDuet-1或pET4CDS。

进一步的，所述多顺反子表达系统通过双顺反子质粒和/或单顺反子质粒构建，所述双顺反子质粒和所述单顺反子质粒为具有不同抗性基因的质粒。