[发明专利]真皮毛乳头细胞球及其体外培养方法、囊泡和用途

说明书

本发明属于生物材料和再生医学领域，具体涉及一种真皮毛乳头细胞球及其体外培养方法、囊泡和用途。该真皮毛乳头细胞球是按照以下方法制备得到：从离体真皮毛乳头组织中提取原代真皮毛乳头细胞，传代培养3～5代；将传代后的真皮毛乳头细胞接种于SLF‑3D培养体系中培养，待真皮毛乳头细胞生长融合度为90～100％时，收集半悬浮的球体，将球体分离成为单个细胞，再将单个细胞重新接种到原SLF‑3D培养体系中培养3～5d，收集形成的悬浮球体，即为真皮毛乳头细胞球体。本发明提供的真皮毛乳头细胞球及其囊泡具有更好的创面无瘢痕愈合的治疗效果。

技术领域

本发明属于生物材料和再生医学领域，具体涉及一种真皮毛乳头细胞球及其体外培养方法、囊泡和用途。

背景技术

全层皮肤缺损的创面组织结构往往无法再生，会以瘢痕形式修复。瘢痕不仅影响外观，而且缺乏皮肤附属器、胶原过度沉积、纤维排列紊乱，组织延展性及抗张能力差，严重影响患者生活质量。尽管创面愈合的治疗策略取得了较大进展，但创面的愈合质量仍然不令人满意。因此，开发一种有效的治疗方法，加速和改善创面愈合便显得尤为重要。近年来，研究发现毛囊及相关干细胞能减少创面愈合后的瘢痕形成。成年小鼠创面新生毛囊周围皮肤组织接近正常皮肤，提示毛囊可能是皮肤再生的关键。临床上利用人体毛囊单位移植修复自体难治性创面的研究证明，移植的毛囊单位可以快速有效地修复患者的严重创面。

毛乳头细胞(DPCs)是一种特化的间充质干细胞，其位于毛囊的基底部，具有较强的干细胞特性，在特定条件下可向多种细胞分化。毛乳头细胞通过分泌多种生长因子和细胞因子来调节细胞增殖、毛囊发育和血管生成，在上皮-间充质相互作用和毛囊再生中发挥着重要作用，现已成为毛囊再生最为重要的真皮来源干细胞。目前，关于毛囊及相关干细胞在创面愈合过程中减少瘢痕形成的研究尚处于起步阶段，与脂肪干细胞、骨髓干细胞等其它间充质干细胞相比较，DPCs除了能促进新生血管生成、减轻炎症、促进愈合之外，还可改善后期瘢痕情况。此外，DPCs可取自于头发、胡须等人体各部位的体毛，相比其他来源的间充质干细胞具有易于获取，来源丰富，没有伦理限制等优势，在组织再生、创面修复、靶向治疗载体细胞等方面有着广大的应用前景，已被认为是创面无瘢痕愈合的关键的种子细胞。然而，尚无3D真皮毛乳头细胞球(tdDPCs)在促进创面愈合，特别是瘢痕治疗方面的研究报道和相关产品。

发明内容

鉴于以上技术问题，本发明提供以下技术方案：

本发明第一个目的，提供一种真皮毛乳头细胞球的体外培养离方法，包括以下步骤：

从离体真皮毛乳头组织中提取原代真皮毛乳头细胞，传代培养3～5代；

将传代后的真皮毛乳头细胞接种于SLF-3D培养体系中培养，待真皮毛乳头细胞生长至融合度为90～100％时，收集半悬浮的球体，将球体分离成为单个细胞，再将单个细胞重新接种到原SLF-3D培养体系中培养3～5d，收集形成的悬浮球体，即为真皮毛乳头细胞球；

其中，所述SLF-3D培养体系是以DEME/F-12作为溶剂，以所述SLF-3D培养体系的总体积计，所述SLF-3D培养体系还包括以下原料：2～3％胎牛血清_、人碱性成纤维细胞生长因子4～6ng/mL、人表皮生长因子0.8～3ng/mL、人血小板衍生生长因子4～6ng/mL、肝素1～3ug/mL、L-抗坏血酸-2-磷酸倍半钠水合物30～60ug/mL、青霉素80～120U/mL。

优选地，所述真皮毛乳头细胞在SLF-3D培养液中的接种量为5～6×10⁴个/cm²。

优选地，以所述SLF-3D培养体系的总体积计，所述SLF-3D培养体系包括以下原料：3％胎牛血清_、人碱性成纤维细胞生长因子5ng/mL、人表皮生长因子2ng/mL、人血小板衍生生长因子5ng/mL、肝素2ug/mL、L-抗坏血酸-2-磷酸倍半钠水合物50ug/mL、青霉素100U/mL。