[发明专利]一种敲除基因的重组大肠杆菌及其构建方法

权利要求书

1.一种敲除基因的重组大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌经过基因敲除处理且包含有基因重组质粒，所述基因敲除的基因为adhE、ptsG、Crr、ldhA、pflB、pta、poxB、acka或arcA中的一种或多种。

2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述基因敲除的基因为ldhA、pflB、pta、poxB、acka和arcA。

3.如权利要求2所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述敲除基因的重组大肠杆菌的保藏号为CGMCC NO.26003，保存地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存时间为2022年10月31日。

4.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，通过以下方法构建：

步骤1，对大肠杆菌进行基因敲除，获得基因敲除的大肠杆菌；

步骤2，构建基因重组质粒；

步骤3，将步骤2构建得到的基因重组质粒通过化学转化的方法转入所述基因敲除的大肠杆菌中，得到所述重组大肠杆菌，将所述重组大肠杆菌的菌株保藏备用。

5.如权利要求4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述步骤1中基因敲除通过以下方法进行：

步骤S1，将pCAS质粒导入含有待敲除基因的底盘细胞中；

步骤S2，合成sgRNA引物，进行全质粒PCR，以pTarget质粒为模板，通过PCR取代pTarget质粒上20bp的N20序列；

步骤S3，胶回收PCR获得pTarget质粒，使用kpnI酶对所述pTarget质粒消化后直接磷酸化，然后环化自连，直接转化到菌株中，测序正确后提取消除后的pTarget质粒；

步骤S4，根据基因组的序列，在待敲除基因上游和下游各选择500bp片段设计引物，所述引物的总长为50bp，PCR过后胶回收上游片段和下游片段，之后再以上游的正向引物和下游的反向引物回收上游片段和下游片段，回收的所述上游片段和下游片段为template做融合PCR，回收后连接至T载体上，测序正确后大量扩增，胶回收后达到的产物浓度为300-500ng/μL；

步骤S5，先把含有pCAS质粒的底盘细胞培养至OD₆₀₀为第一预定吸光值，然后加入阿拉伯糖进行诱导，诱导产生重组酶，所述诱导的时间至少一个小时，待OD₆₀₀达到第二预定吸光值时，制作电转感受态细胞；

步骤S6，将获得的pTarget质粒和template按照1：4的比例加入到所述电转感受态细胞中，进行电转化；

步骤S7，将步骤S6得到的电转化后的电转感受态细胞涂布到含有Str和Kana的平板上，长出菌落后做菌落PCR，以确定pCAS质粒是否删除；

步骤S8，确定pCAS质粒删除后，挑取单菌落，诱导sg-RNA-Pmb1序列定位到pTarget质粒上，消除pTarget质粒，涂单抗Kana板和双抗板，以确定pTarget被消除；

步骤S9，对步骤S8得到的菌落进行培养，涂板挑取单菌落，获得pCAS消除的菌株，即为经过基因敲除的大肠杆菌。

6.如权利要求5所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述步骤S3中，所述消除后的pTarget质粒的浓度为200-300ng/μL。

7.如权利要求5所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述步骤S4中，上游片段的反向引物带有下游片段25bp，下游片段的正向引物带有上游片段25bp，然后设计相应的另一引物。

8.如权利要求5所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述第一预定吸光值为0.1-0.4，所述第二预定吸光值为0.5-0.8。