[发明专利]一种敲除基因的重组大肠杆菌及其构建方法

说明书

一种敲除基因的重组大肠杆菌，所述大肠杆菌经过基因敲除处理且包含有基因重组质粒，所述基因敲除的基因为adhE、ptsG、Crr、ldhA、pflB、pta、poxB、acka或arcA中的一种或多种。本发明所述的大肠杆菌经过基因敲除处理且包含有基因重组质粒利用，基因敲除和基因重组质粒二者协同作用有效提高了丁二酸的产率，具体的，本发明利用Crispr技术敲除大肠杆菌中ptsG和crr基因减少前提物质烯醇式丙酮酸的消耗，敲除大肠杆菌中ldhA、pflB、pta、poxB、acka和arcA基因减少副产物乳酸、乙醇、甲酸、乙酸的合成，从而有效降低了丁二酸的生产成本。

技术领域

本发明涉及生物发酵技术领域，特别是涉及一种敲除基因的重组大肠杆菌及其构建方法。

背景技术

丁二酸又称琥珀酸，其重要用途之一为制备五元杂环化合物，其脱水生成的琥珀酸苷是制备药物、染料和醇酸树脂的重要原料，同时，丁二酸在医药上有抗痉挛、祛痰和利尿作用，还可以应用于食品调味领域，正因为其应用广泛，所以每年全球对其需求量巨大。

目前市场中绝大部分的丁二酸为石化法制得，主要通过顺丁烯二酸酐或反丁烯二酸在催化剂作用下加氢反应制得，而石油资源紧缺，环境污染巨大，所以急需一种绿色的可替代的丁二酸制备方法。大肠杆菌发酵制备丁二酸生产成本具有竞争力；利用可再生的农业资源包括二氧化碳作为原料，避免了对石化原料的依赖；减少了化学合成工艺对环境的污染，但是现有技术中，大肠杆菌发酵制备丁二酸时往往会甲酸、乙醇和丙酮酸等副产物，由于其极性近似，生物发酵法制备丁二酸的成本被大大提高。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的大肠杆菌发酵制备丁二酸副产物多，分离成本高，而提供一种敲除基因的重组大肠杆菌。

本发明的另一目的，提供一种所述重组大肠杆菌的构建方法。

为实现本发明的目的所采用的技术方案是：

一种敲除基因的重组大肠杆菌，所述大肠杆菌经过基因敲除处理且包含有基因重组质粒，所述基因敲除的基因为adhE、ptsG、Crr、ldhA、pflB、pta、poxB、acka或arcA中的一种或多种。

在上述技术方案中，所述基因敲除的基因为ldhA、pflB、pta、poxB、acka和arcA。

在上述技术方案中，所述敲除基因的重组大肠杆菌的保藏号为CGMCC NO.26003，保存地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保存时间为2022年10月31日，所述重组大肠杆菌的建议的分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。

在上述技术方案中，所述重组大肠杆菌通过以下方法构建：

步骤1，对大肠杆菌进行基因敲除，获得基因敲除的大肠杆菌；

步骤2，构建基因重组质粒；

步骤3，将步骤2构建得到的基因重组质粒通过化学转化的方法转入所述基因敲除的大肠杆菌中，得到所述重组大肠杆菌，将所述重组大肠杆菌的菌株保藏备用。

在上述技术方案中，所述步骤1中基因敲除通过以下方法进行：

步骤S1，将pCAS质粒导入含有待敲除基因的底盘细胞中；

步骤S2，合成sgRNA引物，进行全质粒PCR，以pTarget质粒为模板，通过PCR取代pTarget质粒上20bp的N20序列；

步骤S3，胶回收PCR获得pTarget质粒，使用kpnI酶对所述pTarget质粒消化后直接磷酸化，然后环化自连，直接转化到菌株中，测序正确后提取消除后的pTarget质粒；