[发明专利]乳铁蛋白定量检测方法

说明书

本发明属于检测领域，涉及一种乳铁蛋白定量检测方法，所述方法包括：检测的步骤，其使用二维色谱装置和检测器对含有乳铁蛋白的样品进行定量检测，所述二维色谱装置包括一维色谱系统和二维色谱系统，其中，所述一维色谱系统包括乳铁蛋白特异性亲和色谱柱以及乳铁蛋白捕获色谱柱，所述二维色谱系统包括反相色谱柱，所述一维色谱系统与二维色谱系统通过多通阀组进行连接或切换，并且，所述检测的步骤中：所述含有乳铁蛋白的样品中的乳铁蛋白在所述乳铁蛋白特异性亲和色谱柱中纯化后在所述乳铁蛋白捕获色谱柱中进行富集，进而通过所述二维色谱系统后被所述检测器检测。

技术领域

本发明属于检测领域，特别是涉及蛋白/肽物质的分离和分析的检测领域，具体涉及一种乳铁蛋白的定量分析的方法，尤其是乳制品中乳铁蛋白含量的定量分析。

背景技术

乳铁蛋白(Lf)是一种天然蛋白质，是碱性蛋白的一种，其主要由乳腺上皮细胞表达和分泌，广泛存在于动物乳汁中，是一种双叶铁结合的球状糖蛋白，相对分子质量为70～80kDa。乳铁蛋白在人初乳中含量较高，浓度为6～8mg/mL；奶牛初乳中浓度为1～2mg/mL，而在常乳中含量较低，人常乳中浓度为1～2mg/mL，奶牛常乳中浓度为0.02～0.35mg/mL。不同哺乳阶段乳汁中乳铁蛋白含量不断变化。

乳铁蛋白具有以下主要作用：调节机体的免疫反应、调节胃肠道铁的吸收、广谱抗菌作用、抗病毒、抗氧化、抗癌以及同药物的协同作用。因此，乳铁蛋白作为功能性成分，已经被应用到很多领域，诸如食品、医药、口腔医学等方面。

目前乳制品、乳粉领域中，均没有与食品中乳铁蛋白测定相关的标准。目前比较主流的乳制品中Lf的测定方法通常为色谱法（RP-HPLC）、光谱法、基于表面等离子体共振（SPR）的免疫传感器、毛细管电泳法（CE）法、酶联免疫法（ELISA）和超高效液相色谱-串联质谱光谱法（UHPLC-MS/MS）。

其中，酶联免疫吸附法（ELISA）常用于乳制品中Lf的定量，液态乳中的定量范围为0.73~9.84mg/mL，乳粉中Lf的定量范围为5~600ng/mL。ELISA分析具有高度的特异性，结果分布属于偏态分布，因此，有可能会导致假阴性或测定结果误差过大，而且，该方法在使用过程中需要多次洗涤和培养的过程。

超高效液相色谱-串联质谱光谱法（UHPLC-MS/MS）虽然可高灵敏地测定乳制品中的Lf，但该方法是基于Lf 经胰蛋白酶水解后的特征肽进行定性和定量，需要使用稳定同位素标记的肽段作为内标，价格昂贵，而且不能分辨活性乳Lf与非活性Lf。

基于表面等离子体共振（SPR）的生物传感器免疫分析法也已开发使用，定量范围为1~1000 ng/mL，与ELISA分析方法类似，结果分布属于偏态分布，两次结果直接误差过大，很难对结果进行判定。

Lf也可以通过电泳方法检测，包括凝胶电泳和毛细管电泳分析。另外，包括反相高效液相色谱（RP-HPLC）、离子交换色谱（IEC）和亲和色谱几种色谱技术可用于分析Lf含量。

目前领域内多采用液相色谱方法，但是前处理复杂、成本高，重现性需要具有大量实验经验的人才能保障。

引用文献1公开了一种乳铁蛋白提取用结合缓冲液，该集合缓冲液包括十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、提取试剂和水。用其作为乳铁蛋白的提取液，能够保证亲和柱对乳品中乳铁蛋白的结合能力。之后将吸附于柱上的乳铁蛋白进行洗脱，并可以对洗脱液进行HPLC极性分析和测定。

引用文献2公开了一种快速分离富集乳制品中乳铁蛋白的方法，其通过一种硼酸官能化聚合物材料用于选择性富集乳制品中乳铁蛋白，之后，将吸附的乳铁蛋白脱附，再使用HPLC进行分析和测定。

引用文献3公开了一种测定乳制品中乳铁蛋白的高效亲和色谱法：将分离了脂肪和酪蛋白的测试液采用高效液相色谱系统分离检测，所采用的色谱柱为亲和层析柱，检测器为二极管阵列检测器。