[发明专利]一种鉴定圆果杜英的DNA条形码、鉴定方法与应用

说明书

本发明提供了一种鉴定圆果杜英的DNA条形码、鉴定方法与应用，属于物种鉴定技术领域，所述DNA条形码包括ycf1、trnS‑atpA和ITS基因序列中的一种或多种。本发明首次提供的鉴定圆果杜英的DNA条形码有利于实现圆果杜英的分子鉴定，有效缩短鉴定的时间，且本发明利用ycf1、trnS‑atpA、ITS的联合基因片段鉴定效率高，鉴定效率为100％，极大地提高了圆果杜英分子鉴定的成功率。本发明的鉴定方法利用检测引物或试剂盒进行PCR扩增获得圆果杜英ycf1、trnS‑atpA、ITS序列，然后将扩增序列应用于构建杜英属的系统发育树，实现对圆果杜英的精准鉴定，且鉴定方法简单、快速、效率高、重复性好。

技术领域

本发明属于物种鉴定技术领域，尤其涉及一种鉴定圆果杜英的DNA条形码、鉴定方法与应用。

背景技术

圆果杜英是杜英科杜英属植物。圆果杜英的种子(包括内果皮)是串珠(金刚菩提)的重要原材料，由其串在一起制作成念珠，是东方宗教的重要元素。因其较高的经济价值，圆果杜英被列入濒危野生动植物种国际贸易公约(CETS)，是我国粤港澳海关检疫执法常见送检植物。但是市场上金刚菩提的来源极其复杂，如杜英属的毛果杜英，褐毛杜英的果实也被当做圆果杜英来销售。因此，急需开发有效的圆果杜英鉴定方法。然而传统的鉴定方法均存在不同程度的局限，如性状鉴定主要依据叶片的形状，子房几室来区分物种。不同物种间的性状会有重叠，种间特征性状界限模糊，分类鉴定较为困难。其次鉴定人员受物种采摘的生境变化、物种生长状况差异和个人鉴定经验的影响，其鉴定结果常常缺乏准确性和可重复性。因此开发一种更简便、快捷、准确、高效的圆果杜英鉴别方法迫在眉睫。

DNA条形码(DNA barcoding)是指生物体内能够代表该物种的、标准的、易扩增且相对较短的DNA片段，该段DNA序列能快速、准确的鉴定物种。2003年加拿大动物学家PaulHebert首次提出DNA条形码的概念，之后DNA条形码逐渐应用于植物体中。目前我国已有大量的学者相继对植物进行了DNA条形码序列筛选及鉴定研究，其中国际生命条形码联盟植物工作组建议将rbcL和matK基因片段作为植物的核心条形码，叶绿体psbA-trnH片段和核基因ITS片段为补充条形码。2015年Phoon利用上述标准条形码片段以及trnL-trnF和trnV-ndhC基因片段构建系统发育树，但是构建的系统发育树建树结果不理想。因此选择一个更全面、更实用的圆果杜英DNA条形码鉴定体系仍是亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鉴定圆果杜英的DNA条形码、鉴定方法与应用，本发明利用圆果杜英的DNA条形码实现了对圆果杜英的精准鉴定，且鉴定方法简单、快速、效率高、重复性好。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种鉴定圆果杜英的DNA条形码，所述DNA条形码包括ycf1、trnS-atpA和ITS基因序列中的一种或多种；所述ycf1的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述trnS-atpA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述ITS的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了一种鉴定圆果杜英的引物组，所述引物组包括ycf1引物、trnS-atpA引物和ITS引物中的一种或多种；所述ycf1的引物序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，所述trnS-atpA的引物序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示，所述ITS的引物序列如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示。

本发明还提供了一种鉴定圆果杜英的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组。

优选的，所述试剂盒还包括PCR扩增反应体系，所述PCR扩增反应体系包括DNA模板2μL，10×Dream Taq Greenbuffer 5μL，dNTP Mix 5μL，DMSO 2μL，BSA 0.5μL，正向引物2μL，反向引物2μL，Dream Taq DNAPloymrerase 1.5μL，双蒸水加至50μL。