[发明专利]一种提高内源酶分泌的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种提高内源酶分泌的基因工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明以多聚半乳糖醛酸酶这一内源酶为切入点，通过对正常菌株和敲除多聚半乳糖醛酸酶的菌株进行转录组测序分析，筛选出与内源酶分泌相关的关键基因Km_10019，通过实验验证该基因调控内源酶的胞外分泌。本发明对马克思克鲁维酵母进行基因工程改造，获得Km_10019过表达的基因工程菌，该菌株分泌多聚半乳糖醛酸酶的量是对照的1.7倍，本发明为蛋白分泌系统优化提供理论基础和相关基因，对于蛋白酶制剂的开发具有重要意义。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及基于转录组分析结果构建的一种提高内源酶分泌的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

随着社会的发展，传统的化学制造所造成环境污染、高能耗和生态恶化等问题引起社会高度重视，因此需要对工业生产废弃物或废水进行处理以满足排放要求。水果罐头加工、果酱生产、果胶生产与使用企业产生含果胶的废水，称之为果胶废水，果胶废水中含有高浓度的果胶，如何去除果胶是该类废水处理的关键。

目前常规的处理方式是通过预处理分离大部分果胶，然后通过生化处理进一步降解去除果胶。主要包括复合絮凝剂处理、混凝-吸附法处理、果胶酶处理、微生物分解处理。通过絮凝剂与果胶分子形成絮体而去除果胶是最快捷的去除果胶的方法，但容易产生二次污染，且后续程序繁琐。酶属于生物催化剂，具有专一性强、作用条件温和以及可生物降解等特点，利用果胶酶处理可以达到很好的效果，不仅对能源的消耗，废弃物的排放有重要的作用，还可以给社会带来巨大的经济效益。

目前，酵母已经被证明在表达异源蛋白方面具有很大的优势，不仅生长速度快，可进行蛋白翻译后修饰、易于遗传操作、可发酵，高生物量浓度和安全的无病原体生产而且还能将蛋白分泌到培养基，因此具有广泛的应用价值。

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)广泛存在于酸奶、水果、酸乳酒等环境中，是一种食品安全级酵母，具有生长周期短、耐高温、等优点。马克斯克鲁维酵母具有内源性的多聚半乳糖醛酸水解酶(果胶酶)，因此，马克斯克鲁维酵母是一种理想的生产果胶酶的宿主。然而马克斯克鲁维酵母内源性果胶酶的分泌表达被限制在相对较低的水平，因此，需要对马克斯克鲁维酵母进行分子工程改造以优化其分泌途径提高果胶酶的分泌量。

目前有很多基因被报道与蛋白分泌有关，有研究表明，过量表达ATPases Hsp70家族中的伴侣基因BiP可以提高酿酒酵母中的蛋白质分泌，例如人促红细胞生成素分泌增加5倍(Protein Disulfide Isomerase Overexpression Increases Secretion of ForeignProteins in Saccharomyces cerevisiae[J].Biotechnology,1994,12(4):381-384)，牛凝乳酶原增加26倍(Overexpression of binding protein and disruption of the PMR1gene synergistically stimulate secretion of bovine prochymosin but not plantthaumatin in yeast[J].Applied MicrobiologyBiotechnology,1996,46(4):365-70.)，而且在一些情况下，BiP表达降低会导致外源蛋白减少，但是BiP的过表达作用是蛋白质或宿主特异的，不是在所有情况下都有益。

通过分析马克斯克鲁维酵母转录水平，挖掘与果胶酶蛋白分泌相关基因，探究酵母蛋白分泌机制，构建提高内源酶分泌的基因工程菌对蛋白酶开发具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于通过对马克斯克鲁维酵母转录水平分析，筛选与内源酶分泌相关基因，为优化蛋白分泌系统提供基础。通过基因工程改造构建一种提高内源酶分泌的基因工程菌，应用于蛋白酶的开发。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：