[发明专利]一种筛选高产DHA裂殖壶菌的方法及其应用

说明书

本发明提供了一种筛选高产DHA裂殖壶菌的方法及其应用，涉及生物技术领域。本发明提供了一种筛选高产DHA裂殖壶菌的方法，与传统培养方法相比，可以节省原料30倍的培养基，同时整个筛选过程仅仅需要8天，便可实现同时对四五百到上千株预筛高产DHA单菌落进行筛选，大大缩短了筛选时间。而且，本发明首次利用深孔板发酵模拟摇瓶发酵，显著提高了筛选通量和筛选效率。通过试验可知，利用本发明述筛选方法最终得到一株EU432裂殖壶菌，经三角瓶发酵DCW、脂质产量和DHA产量分别达到了39.71g/L、24.93g/L和8.90g/L，相较于原始菌株脂质产量和DHA产量分别提升了8.53％和21.58％。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种筛选高产DHA裂殖壶菌的方法及其应用。

背景技术

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)是一种ω-3多不饱和脂肪酸，具有促进婴幼儿大脑生长发育、维持视网膜正常功能、癌症治疗、抗炎、预防心血管疾病等功效。目前，DHA主要来源于鱼油和微藻油当中，由于鱼油的纯化工艺复杂、对海洋资源的消耗大以及脂质内易残存海洋环境污染物等因素，使得DHA藻油的需求量逐渐增加，其中最有待解决的问题便是发酵成本以及提升产量的问题，以满足目前世界对DHA需求的快度增长。裂殖壶菌作为生产DHA重要的工业菌株，从经济上来讲，裂殖壶菌中得到DHA藻油的成本依然是鱼类中得到鱼油的1～2倍。为降低生产成本，目前相关研究主要集中在菌种选育、发酵过程优化、油脂提取优化及基因编辑等方面。

有研究利用尼罗红染色作为高通量筛选方法，但前期培养均需要消耗大量培养基，并且染色方法没有优化而效率不高。还有一些报道用流式细胞仪通过荧光染色进行细胞分选，David筛选出的菌株比野生菌株脂质产量提升了123％，然而这种方法分选后活细胞的百分比较低(40-50％)，而且分选前需要两周的细胞培养，最终依然需要对待选菌株的大量筛选。关于裂殖壶菌的诱变育种中，大多数文献利用ARTP或其他方式进行诱变，在添加抑制剂上进行筛选，最后通过传统的方法进行培养。这些文章多注重于报导诱变方法和抑制剂的使用，而缺少一个程序化高通量的筛选方法，以至于筛选时间长、资源不能充分利用以及筛选工作量大的问题。因此，有关高通量筛选裂殖壶菌的方法仍然需要进一步探索优化。

高通量筛选在微生物培养发酵方面有着较为广泛的应用，为了提高效率扩大筛选范围，常常利用孔板进行发酵试验，以达到高效、节省原料和能源及降低试验空间的目的。目前利用孔板进行酶、蛋白质、有机酸、啤酒发酵及一些其他产物的优化和菌种筛选的工作，裂殖壶菌利用深孔板进行高通量育种的方法没有相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种筛选高产DHA裂殖壶菌的方法，能够大大减少培养基的使用，缩短筛选时间，同时能够显著提高筛选通量和筛选效率。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种筛选高产DHA裂殖壶菌的方法，所述方法包括如下步骤：

挑取潜在高产诱变菌株于48深孔板进行初筛发酵培养，得到裂殖壶菌菌悬液；在含有二甲基亚砜溶液的96深孔板中依次添加所述裂殖壶菌菌悬液和尼罗红染液，测定OD₆₆₀以及水浴染色后测定的裂殖壶菌荧光强度FI，选择FI/OD₆₆₀最大的菌株便可得到拟高产菌株；

将所述拟高产菌株添加到48深孔板中进行复筛发酵培养，通过测定所述发酵产物中的DHA含量即可筛选得到高产DHA的裂殖壶菌。

优选的，所述深孔板包括发酵孔和盖板；所述盖板包括上、中、下三层，所述上层为不锈钢板，所述中层为硅胶垫，所述下层为滤膜材料。

更优选的，所述发酵孔的体积为2.2-7mL。

更优选的，所述不锈钢板和硅胶垫上均匀分布有透气孔，所述透气孔的孔径为1.5-6mm；所述滤膜材料的孔径为0.22μm。