[发明专利]一种消除副产物的重组结节链霉菌、构建方法及应用

权利要求书

1.一种消除副产物AmA且高产两性霉素B的重组结节链霉菌，由如下方法构建获得：以结节链霉菌CCTCC NO：M 2017426为底盘菌，突变其聚酮合酶ER5结构域关键结催化位点，将其聚酮合酶ER5结构域氨基酸序列中的QSFDLAFVDPEVIGAMGR突变为QSFDLAFVAPEVIGAMGR，得到结节链霉菌ZJB2016050-N1，即所述消除副产物AmA且高产两性霉素B的重组结节链霉菌。

2.构建权利要求1所述重组结节链霉菌的方法，其特征在于所述方法如下：(1)PCR克隆获得核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的聚酮合酶ER5结构域基因，将ER5结构域中关键氨基酸序列QSFDLAFVDPEVIGAMGR突变为QSFDLAFVAPEVIGAMGR，扩增获得突变位点上游和下游同源臂片段，插入pJTU1278载体质粒多克隆位点处，得到重组载体pJTU1278-ER5N1；

(2)将步骤(1)中得到的重组载体pJTU1278-ER5N1转化入大肠杆菌DH5α，对得到的转化子进行测序，将确认无误的载体导入供体菌大肠杆菌；

(3)将步骤(2)构建的含有重组质粒pJTU1278-ER5N1的供体菌株大肠杆菌通过接合转移方法将过表达载体转化到受体菌结节链霉菌ZJB2016050，得到基因工程菌ZJB2016050-N1，即所述消除副产物AmA且高产两性霉素B的重组结节链霉菌。

3.权利要求1所述重组结节链霉菌在微生物发酵制备两性霉素B中的应用。

4.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述重组结节链霉菌接种至发酵培养基中，于25～30℃、100～300rpm条件下进行发酵培养72～168h，发酵结束后取发酵液上清分离纯化得到两性霉素B。

5.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述发酵培养基组成如下：葡萄糖60～80g/L，牛肉膏5～10g/L，大豆蛋白粉5～10g/L，棉子粉8～30g/L，CaCO₃ 5～10g/L，KH₂PO₄ 0.1～0.4g/L，溶剂为水，pH 7.0，115℃灭菌30min。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述重组结节链霉菌先经种子培养，再将种子液以体积浓度2～10％的接种量接种至发酵培养基，所述种子培养过程如下：将所述重组结节链霉菌接种在GYM平板上，25～28℃生长3～7天，收集灰色的孢子制成孢子悬液；将孢子悬液接种至种子培养基25～28℃培养24～48h，获得种子液；所述GYM平板终浓度组成：葡萄糖1～5g/L，酵母粉1～5g/L，麦芽提取物5～29g/L，碳酸钙1～3g/L，琼脂15～20g/L，溶剂为水，pH7.0～7.5，115℃灭菌30min；所述种子液培养基终浓度组成为：蛋白胨10～20g/L，NaCl 5～10g/L，葡萄糖10～15g/L，酵母粉5～10g/L，CaCO₃ 0.5～1g/L，溶剂为水，pH 7.0～7.2，115℃灭菌30min。